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Titel:Speziesspezifische proteomische Aspekte der axonalen Regeneration retinaler Ganglienzellen am Beispiel der Ratte (Rattus norvegicus) und des Affen (Callithrix jacchus)
Autor:Rose, Karin
Weitere Beteiligte: Imming, Peter (Prof. Dr.)
Erscheinungsjahr:2004
URI:http://archiv.ub.uni-marburg.de/diss/z2004/0695
URN: urn:nbn:de:hebis:04-z2004-06950
DOI: https://doi.org/10.17192/z2004.0695
DDC: Medizin, Gesundheit
Titel(trans.):Species-specific proteomic aspects of regenerating retinal ganglion cells in the rat (Rattus norvegicus) and the monkey (Callithrix jacchus)

Dokument

Schlagwörter:
Axonale Regeneration, Proteome analysis, Neuron, Retina, Nervenzelle, Axonal regeneration, Proteomanalyse, Retina

Zusammenfassung:
Die axonale Regeneration im Zentralen Nervensystem (ZNS) ist ein äußerst komplexer Vorgang, der unter natürlichen Bedingungen nicht stattfindet, gleichwohl jedoch prinzipiell möglich ist. So unterliegen axotomierte RGZ der adulten Ratte einem progressiven Degenerationsprozeß, können jedoch nach entsprechender Vorbehandlung und experimentellen Bedingungen partiell regenerieren. Ziel der Regenerationsforschung ist es daher, durch gezielte Modulation bzw. Applikation von Wirkstoffen das Fortschreiten des Zelltodes aufzuhalten und die Neurone zur axonalen Regeneration zu stimulieren. Im Rahmen dieser Dissertation sollten regenerationsassoziierte Proteinexpressionsveränderungen untersucht werden, um ein tieferes Verständnis der molekularen Mechanismen zu erlangen und neue Ansatzpunkte zur gezielten Stimulation der Regeneration zu finden. Dazu wurden zunächst Untersuchungen am etablierten Regenerationsmodell der Rattenretina vorgenommen, bei der eine parallel zur konditionierenden Quetschung des ON gesetzte Linsenverletzung zur verstärkten Regeneration führt. Durch morphologische, biochemische und immunhistochemische Analysen konnte gezeigt werden, dass die regenerationsstimulierende Wirkung der Linsenverletzung über andere Signalkaskaden vermittelt wird, als die nach Quetschung. Neben der von anderen Gruppen postulierten Aktivierung von Makrophagen, konnten hier der neurotrophe Faktor bFGF und die alpha-, beta-, und gamma-Kristalline als mögliche Vermittler dieser Effekte bestimmt werden. Neben diesem vorbehandlungsabhängigen Modell der Rattenretina wurde ein spontan regenerierendes System in Form der Affenretina gefunden, etabliert und charakterisiert. Dieses zeigte eine im Vergleich zur Rattenretina höhere Substratspezifität und erlaubte die Untersuchung altersspezifischer Regenerationsvorgänge. Biochemische und immunhistochemische Untersuchungen offenbarten speziesübergreifende Proteomveränderungen infolge axonaler Regenerationsprozesse. So konnten in beiden Modellen die verstärkte Expression eines GAP-43-ähnlichen Proteins in regenerierten Zuständen nachgewiesen werden. Die parallele verstärkte Expression von GFAP demonstrierte eine speziesübergreifende, entscheidende Rolle der Glia für das Regenerationsgeschehen und stand nicht im Widerspruch zu einer erfolgreichen Regeneration. Darüberhinaus zeigten Kristalline in beiden Modellen eine Veränderung ihrer Expression und Lokalisation im Zuge der Regeneration, die ihre fundamentale Bedeutung für diese Prozesse nahelegen. Zur erweiterten Beobachtung der differentiellen Proteinexpression wurde die Technik der 2D-PAGE etabliert und die hochaufgelöste Darstellung des Retinaproteoms optimiert. In Kombination mit MALDI-MS wurde eine Kartierung des Retinaproteoms der Ratte und des Affen vorgenommen. Es wurden 32 (Rattenretina) bzw. 23 Proteine (Affenretina) unterschiedlicher Funktion und Lokalisation identifiziert und Proteomkarten der Retinae beider Spezies als Basis für weitere, nachfolgende Untersuchungen unter variablen Aspekten generiert. Die proteomische Analyse regenerierter und nicht-regenerierter Retinae offenbarte die differentielle Regulation verschiedener Proteine. Bei dem Modell der Rattenretina konnten zwei unter nicht-regenerativen Bedingungen verstärkt exprimierte Proteine als Synaptotagmin I und High mobility group protein-1 (HMG-1) identifiziert werden. Komparative Analysen der 2D-Gele des Affen offenbarten die alters- und regenerationsabhängige Expression mehrerer Proteine, die als Calmodulin, alpha A-Kristallin, Fatty-acid binding protein (FABP) und Cellular retinoic acid bindig protein (CRABP) bestimmt wurden. Aufgrund der bislang bekannten Funktionen dieser Proteine stellen sie interessante Ansatzpunkte für weitere Untersuchungen dar. Diese Arbeit konnte damit zahlreiche in das Regenerationsgeschehen involvierte Faktoren und daran gekoppelte Signalwege offendecken. Durch die weitere funktionelle Untersuchung dieser Kandidaten, insbesondere der Kristalline, muß ihre Bedeutung für die Regeneration geklärt werden. Die generierten Karten der Retinaproteome von Ratte und Affe stellen die Basis für weitere differentielle Analysen unter variablen Aspekten dar. Durch die Etablierung des neuen Regenerationsmodells der Affenretina und der 2D-PAGE bestehen nun ausgezeichnete Möglichkeiten ein besseres Verständnis regenerationsassoziierter Prozesse und weitere Ansatzpunkte zu ihrer Stimulation zu finden.

Summary:
Axonal regeneration in the central nervous system (CNS) is an extremely complex process which, although possible in principle, does not take place under natural conditions. Axotomized retinal ganglion cells (RGCs) from adult rats normally undergo a progressive degeneration process, but regenerate partially under experimental conditions following a conditioned pre-treatment. Therefore the aim of neuroscience research is to delay neuronal degeneration and stimulate axonal regeneration by targeted modulation or application of growth-promoting substances. The aim of this study was to examine regeneration-associated differences in protein expression in order to unravel the molecular mechanisms of degeneration and to develop strategies that stimulate axonal regeneration. To begin with, investigations were carried out on the previously established regeneration model of the adult rat retinal ganglion cells, which display a strong regeneration after a combined pre-treatment involving an optic nerve crush and simultaneous lens injury. Morphological, biochemical and immunohistochemical analysis showed that the lens injury mediates its regeneration-promoting effects by different signalling pathways than those following the crush injury. Previous studies postulated an activation of macrophages as mediators of regeneration, and this study showed that the neurotrophic factor bFGF and the alpha-, beta- and gamma-crystallins could be additional mediators of the regenerative effect. In addition to the rat retina model, the monkey retina was found to be capable of sponataneous regeneration, and was established and characterised. The monkey retina exhibited a higher substrate specificity, which enabled age-dependent regeneration processes to be studied. Biochemical and immunohistochemical studies revealed inter-species proteome variations due to axonal regeneration. Thus, both models showed an enhanced expression of a GAP-43-like protein following regeneration. Simultaneously, the enhanced inter-species up-regulation of GFAP, demonstrates that glia are involved in, but do not contradict the process of regeneration. Furthermore, the crystallins changed their expression and localization in both models, thus demonstrating their fundamental role in regeneration. To analyse the differential protein expression the 2D-PAGE method was established and the high-resolution representation of the retinal proteome was optimized. In combination with MALDI-MS the retinal proteome of the rat and monkey was mapped. Thirty-two (rat retina) and 23 (monkey retina) proteins having a different function and localization were identified, respectively and proteome-maps of both species were generated, providing the basis for further investigations of other retinal diseases. The proteomic analysis of regenerating and non-regenerating retinas revealed that some proteins are differentially regulated. Two of the proteins, up-regulated under non-regenerating conditions in the rat retina, were identified as synaptotagmin I and high mobility group protein 1 (HMG-1). Comparative analysis of the 2D-gels of the monkey retina showed age- and regeneration-dependent expression of some proteins, identified as calmodulin, alpha A-crystallin, fatty acid binding protein (FABP) and cellular retinoic acid binding protein (CRABP). Based on their function these proteins seem to be interesting candidates for further investigations. This study showed that numerous factors and their corresponding signalling pathways are associated with the regeneration process. Functional testing of these candidate proteins, especially the crystallins, has to be performed in order to elucidate their role in regeneration. The generated rat and monkey proteome maps provide a basis for future, differential analysis of variable aspects. The newly established monkey retina regeneration model and the 2D-PAGE offer excellent potential to gain a deeper insight into regeneration-associated processes and to develop strategies that stimulate them.


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