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Titel:On the enzymatic mechanism of 2-hydroxyisocaproyl-CoA dehydratase from Clostridium difficile
Autor:Kim Ji-Hoe
Weitere Beteiligte: Buckel Wolfgang (Prof. Dr.)
Erscheinungsjahr:2004
URI:http://archiv.ub.uni-marburg.de/diss/z2004/0646
URN: urn:nbn:de:hebis:04-z2004-06460
DOI: https://doi.org/10.17192/z2004.0646
DDC:570 Biowissenschaften, Biologie
Titel(trans.):Zum Enzymatichen Mechanismus der 2-Hydroxyisocaproyl-CoA Dehydratase aus Clostridium difficile

Dokument

Schlagwörter:
2-hydroxyisocaproyl-CoA Dehydratase, 2-hydroxyisocaproyl-CoA dehydratase, 2-hydroxyisocaproyl-CoA dehydratase

Summary:
Die Gene ldhA und hadA aus Clostridium difficile (DSMZ 1296T) wurden kloniert und in Escherichia coli exprimiert. Die erhaltenen Proteine wurden gereinigt und als D-2-Hydroxyisocaproat-Dehydrogenase (LdhA) und 2-Hydroxyisocaproat-CoA-Transferase (HadA) identifiziert. Die Enzyme katalysieren zwei Schritte in der Fermentation von Leucin zu Ammonium, CO2, Isovalerat und Isocaproat. Die nächsten im Genom von C. difficile liegenden Gene hadBC und hadI wurden ebenfalls aktiv exprimiert und als 2-Hydroxyisocaproyl-CoA-Dehydratase (HadBC) und ihrem Aktivator (HadI) identifiziert. Die Dehydratase katalysiert die Eliminierung von Wasser aus (R)-2-Hydroxyisocaproyl-CoA zu Isocaprenoyl-CoA, die eine chemisch schwierige Reaktion darstellt, da das Proton in der b-Position nicht aktiviert ist (pK ca. 40). Wir postulieren, dass erst die Reduktion des Substrats mit einem Elektron die Eliminierung ermöglicht, wobei der pK mindestens bis 14 gesenkt wird. Anschließend wird das Elektron wieder ans Enzym zurückgegeben. Die heterodimere Dehydratase und der homodimere Aktivator sind Eisen-Schwefel-Proteine, in denen keine weiteren prosthetischen Gruppen (oder Metalle wie Molybdän) detektiert werden konnten. Der durch Ferredoxin reduzierte Aktivator überträgt unter ATP-Hydrolyse ein Elektron auf die Dehydratase, die dadurch in den katalytisch aktiven Zustand überführt wird. Dieser ATP-getriebene Elektronen-Transfer ähnelt dem der Nitrogenase. Die aktivierte und vom Aktivator abgetrennte Dehydratase katalysiert ca. 10000 Umsätze bis das Elektron durch Oxidation verloren geht. Durch anschließende Zugabe von ATP und Aktivator kann die inaktivierte Dehydratase wieder voll aktiviert werden. Die Bildung eines stabilen aktiven AlF4--induzierten Komplexes aus Dehydratase und Aktivator stützt den postulierten Elektronentransport vom Aktivator zur Dehydratase und zeigt ebenfalls die Rückgewinnung des benötigten Elektrons nach jedem Turnover. In Übereinstimmung damit werden zur maximalen Aktivität nur substöchiometrische Mengen an Aktivator (Aktivator/Dehydratase = 1:10) benötigt. Mit Hilfe der EPR-Spektroskopie wurde zum ersten Mal während der Dehydratisierung eines 2-Hydroxyacyl-CoA-Derivats ein organisches Radikalsignal detektiert. Mit Hilfe von isotopmarkierten Substraten veränderten sich die EPR-Spektren in einer für das Ketylradikalanion des Isocaprenoyl-CoA charakteristischen Weise.

Zusammenfassung:
The genes ldhA and hadA, from Clostridium difficile (DSMZ 1296T) were cloned and expressed in Escherichia coli. The obtained proteins were purified and characterised as D-2-hydroxyisocaproate dehydrogenase (LdhA) and 2-hydroxyisocaproate CoA-transferase (HadA) involved in two consecutive steps in the pathway of leucine fermentation to ammonia, CO2, isovalerate and isocaproate. The downstream genes hadBC and hadI were also functionally expressed and shown to encode the novel 2-hydroxyisocaproyl-CoA dehydratase (HadBC) and its activator (HadI). The activated dehydratase catalyses the dehydration of (R)-2-hydroxyisocaproyl-CoA to isocaprenoyl-CoA, which is a chemically difficult step since the proton in the b-position is not activated (pK ca. 40). We postulated that the reduction of the substrate by one electron enables the elimination, whereby the pK is lowered to at least 14. After the reaction the electron is returned to the dehydratase, which may catalyse many turnovers. The extremely oxygen-sensitive homodimeric activator as well as the heterodimeric dehydratase contain iron-sulfur cluster(s); other prosthetic groups specifically molybdenum were not detected. The reduced activator transfers one electron to the dehydratase concomitant with hydrolysis of ATP, a process similar to that observed with the unrelated nitrogenase. The reduced dehydratase separated from the activator and ATP catalysed almost 104 dehydration turnovers until the electron was lost by oxidation. By adding activator and ATP the enzyme could be fully reactivated. The active tight complex of the two protein components induced by AlF4- and ATP underpins the postulated electron transfer from the activator to the dehydratase and demonstrates again that the electron is recycled after each turnover. In agreement with this observation, only substoichiometric amounts of activator (activator/dehydratase = 1:10) were required to generate full activity. An organic radical proposed to mediate the dehydration was detected by EPR spectroscopy for the first time in a 2-hydroxyacyl-CoA dehydratase. The changes of the EPR spectra induced by the use of labelled substrates showed that the radical was substrate-derived. These results are the first clear evidence for a radical involved in a dehydration mechanism and suggest a new way to form a radical in enzymatic reactions.


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