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Titel: Diagnostische Bedeutung von Telomerase-Aktivität in Perikardergüssen
Autor: Wittstock, Teja Karsten
Weitere Beteiligte: Schuermann, Prof. Dr. Marcus
Erscheinungsjahr: 2004
URI: https://archiv.ub.uni-marburg.de/diss/z2004/0610
DOI: https://doi.org/10.17192/z2004.0610
URN: urn:nbn:de:hebis:04-z2004-06108
DDC: Medizin, Gesundheit
Titel(trans.): Telomerase activity in pericardial effusions: diagnostic significance

Dokument

Schlagwörter:
Telomerase activity, Telomerase, Telomerase-Aktivität, Pericardial effusion, Perikarderguss, Telomerase, TRAP Assay, TRAP assay

Zusammenfassung:
Die Erkennung von malignen Zellen in Perikardergüssen ist ein bleibendes Problem in der klinischen Diagnostik. Als Goldstandard für die Detektion von Tumorzellen in Ergüssen gilt zur Zeit die Zytologie. Trotzdem werden bei dieser Untersuchung regelmäßig maligne Zellen übersehen. Ziel der vorliegenden Arbeit war es daher, den Nutzen der Telomerase-Aktivitätsmessung für die Begutachtung von Perikardergüssen herauszufinden, um möglicherweise neben der Zytologie ein weiteres Entscheidungskriterium zur Beurteilung der Malignität von Ergüssen zu erhalten. In der vorliegenden Arbeit wurden 31 zytologisch kontrollierte Perikardergüsse auf erhöhte Telomerase-Aktivität mit Hilfe eines konventionellen und eines fluoreszenz-basierten sog. TRAP-Assays (Telomeric Repeat Amplification Protocol) untersucht. Die Ergebnisse des konventionellen TRAP-Assays zeigen eine hohe Korrelation zwischen dem Telomerase-Aktivitätsnachweis und dem zytopathologisch bestätigten Nachweis von malignen Zellen: es konnte eine Sensitivität von 100 % bei einer Spezifität von 91,7 % erreicht werden. Da niedrige Telomerase-Aktivität auch in Stammzellen oder aktivierten Entzündungszellen vorkommt und möglicherweise falsch-positive Ergebnisse provoziert, wurde im weiteren Verlauf der Arbeit versucht, die Aktivität dieses Enzyms zu quantifizieren. Durch die Quantifizierung sollten Rückschlüsse über die Herkunft der Telomerase-Aktivität gewonnen werden. Dazu wurde der fluoreszenz-basierte F-TRAP-Assay etabliert und anhand eines Standards einer telomerase-positiven kleinzelligen Bronchialkarzinomlinie (NCI-H69) kalibriert. Bei den Versuchen wurden nur geringfügige Mess-Schwankungen der Telomerase-Aktivität innerhalb der Verdünnungsreihen registriert. Dies bedeutet eine wenn auch eingeschränkte Quantifizierbarkeit der Telomerase-Aktivität. Daher wurden weitere Untersuchungen vorgenommen, um die Ursache für diese Abweichungen zu ermitteln. Es stellte sich heraus, dass die Schwankungen durch die Elongation und nicht durch die PCR-Amplifikation verursacht werden. Die Elongationsphase stellt damit das Kernproblem bei der Quantifizierung von Telomerase-Aktivität dar. Des Weiteren wurde die Hintergrundaktivität im Perikarderguss anhand von CD34+-Zellen und peripheren mononukleären Zellen aus peripherem Blut überprüft. Diese Untersuchung erfolgte zu dem Zweck, die mögliche Kontamination eines Perikardergusses durch proliferierende Entzündungszellen zu simulieren und gleichzeitig einen Cut-off -Wert für Hintergrundaktivität zu generieren. In beiden Zellarten wurde lediglich ein niedriger Level an Telomerase-Aktivität registriert. Aufgrund der Diskrepanz zwischen den Aktivitätsspiegeln benigner Entzündungszellen im Vergleich zu malignen Tumorzellen konnten Rückschlüsse auf die Herkunft der Telomerase-Aktivität gewonnen werden. Obwohl eine absolute Quantifizierung von Telomerase-Aktivität nicht möglich war, konnte durch die Einführung des Cut-off -Wertes die Spezifität durch den F-TRAP-Assay auf 95,8 % gesteigert werden ohne einen Verlust an Sensitivität hinnehmen zu müssen. Die hohe Sensitivität beider Assays weist auf die besondere Eignung von Perikardzytomaterial für Telomerase-Aktivitätsmessungen hin. Hierzu hat möglicherweise auch eine gute Qualität der verwendeten Proteinextrakte mit einem vermutlich geringen Anteil an Proteinasen und RNAsen beigetragen. Die Ergebnisse beider TRAP-Assays zeigen, dass die Bestimmung der Telomerase-Aktivität ein reliabler Indikator für das Vorhandensein von Tumorzellen in Perikardergüssen ist und damit eine sinnvolle Ergänzung zur zytologischen Untersuchung darstellt. Insbesondere in Zweifelsfällen könnte die Telomerase-Aktivitätsmessung aufschlussreiche Zusatzinformationen bieten. Die Untersuchung wird derzeit aufgrund des methodischen Aufwands jedoch noch Speziallabors vorbehalten sein.

Summary:
The differential diagnosis between malignancy-related and non-malignant pericardial effusions has remained an essential problem in clinical practise. Cytologic examination is considered as gold standard with an average specificity being close to 100 % but still this is not disclaiming the possibility of false positive results. Hence our principal goal was to evaluate the usefulness of the detection of telomerase activity in pericardial effusions to gain another indicator for the presence of tumour cells in effusions. 31 pericardial fluid samples were collected from consecutive, unselected patients undergoing a therapeutic or diagnostic pericardiocentesis. Measurement of telomerase activity was performed with a conventional isotopic and a fluorescence-based TRAP assay (Telomeric Repeat Amplification Protocol). The results of the isotopic TRAP assay indicate a strong correlation between elevated telomerase activity and cytopathologically confirmed presence of malignant cells in pericardial effusions: the sensitivity was 100 % and the specificity was 91,7 %. As low levels of telomerase activity can also be detected in stem cells and hematopoietic progenitor cells false-positive results may occur. For this reason we established a fluorescence based F-TRAP assay allowing the quantitative analysis of telomerase activity. The origin of the telomerase activity should be specified by the quantification.Therefore the fluorescence based assay was calibrated by a dilution standard containing human small cell lung cancer cells (NCI-H69) known to be telomerase-positive. In addition we checked possible background telomerase activity in pericardial effusions by assaying CD34-positive cells and monocytes from peripheral blood. Telomerase activity was detected in low levels in both cell types. A cut-off value for background activity could be determined enabling the discrimination between benign inflammatory and malignant tumour cells. The cut-off value also provided a further increase in specificity up to 95,8 % without a loss of sensitivity. We noticed a relative good quality of extracts obtained allowing a reliable analysis and presume that pericardial effusions may be especially rewarding because of the low presence of RNAses and proteinases secreted by surrounding cells. The results of both TRAP assays indicate that the determination of telomerase activity is a reliable indicator for the presence of tumour cells in pericardial effusions and is therefore a useful adjunctive diagnostic tool for cytological and clinicopathological diagnosis.


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