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Titel:Die Rolle von p53 und der Proteinphosphatase 2C in der neuronalen Apoptose
Autor:Schwarz, Stephanie
Weitere Beteiligte: Krieglstein, Josef (Prof. Dr. Dr.)
Erscheinungsjahr:2004
URI:http://archiv.ub.uni-marburg.de/diss/z2004/0588
DOI: https://doi.org/10.17192/z2004.0588
URN: urn:nbn:de:hebis:04-z2004-05882
DDC: Medizin, Gesundheit
Titel(trans.):On the role of p53 and protein phosphatase type-2C in neuronal apoptosis

Dokument

Schlagwörter:
Phosphatasen, Ölsäure, Globale Ischämie, SH-SY5Y, Apoptosis, SH-SY5Y, Oleic acid, Global ischemia, PP2C, RNA Interferenz, Protein p53, PP2C, RNA interference

Zusammenfassung:
Störungen der neuronalen Apoptose sind an einer ganzen Reihe von Krankheitsbildern beteiligt, darunter so häufige wie Krebs, neurodegenerative Erkrankungen und Schlaganfall. Daher ist es wichtig, die zugrundeliegenden Signalwege zu untersuchen, um die Zusammenhänge aufzuklären und die Möglichkeit der therapeutischen Intervention zu schaffen. Im ersten Teil der vorliegenden Untersuchungen wurden die neuroprotektiven Eigenschaften des p53-Inhibitors Pifithrin-a im in vivo-Modell der transienten globalen Ischämie der Ratte getestet. Die Vorbehandlung mit dem Hemmstoff konnte die Schädigung der hippokampalen CA1-Neurone reduzieren; Pifithrin-a war damit neuroprotektiv. Der Schwerpunkt der Arbeit lag auf der Untersuchung der Rolle der Proteinphosphatase 2C in der ölsäureinduzierten Apoptose. Die Isoformen a und b dieser magnesiumabhängigen Serin/Threonin-Phosphatase werden durch Fettsäuren mit definierten Strukturmerkmalen aktiviert. Für die PP2C-aktivierende Ölsäure konnte im übrigen gezeigt werde, dass sie in bestimmten Systemen Apoptose hervorruft. Um herauszufinden, ob zwischen diesen Ereignissen ein Zusammenhang besteht, wurde zunächst ein Modell etabliert, in dem die Ölsäure in der humanen Neuroblastom-Zelllinie SH-SY5Y konzentrations- und zeitabhängig Apoptose auslöst. Schließlich wurde gezeigt, dass PP2C-aktivierende Fettsäuren sowohl SH-SY5Y-Zellen als auch kultivierte embryonale kortikale Neurone der Ratte schädigen konnten, während nicht-aktivierende zwar ebenso gut von den Zellen aufgenommen wurden, aber keine Apoptose zu induzieren vermochten. PP2Ca wird im Zytosol der SH-SY5Y-Zellen exprimiert, die PP2Cb zusätzlich im Zellkern. Die Behandlung mit Ölsäure änderte nichts an der durch Western Blotting und Immunzytochemie detektierten PP2C-Menge in der Zelle. Auch das PP2C-Substrat Bad wurde untersucht; da es ebenfalls im Zytosol lokalisiert ist, kann es prinzipiell auch in der Zelle mit der PP2C interagieren. Allerdings konnten nach der Behandlung mit Ölsäure eine Regulation weder von Gesamt-Bad noch von phosphoryliertem Bad, detektiert nach Immunpräzipitation, gezeigt werden. Zur Klärung der Beteiligung von Bad an der ölsäureinduzierten Apoptose sind daher weitere Untersuchungen notwendig. Da gegenwärtig noch keine spezifischen PP2C-Inhibitoren verfügbar sind, wurde ein Modell etabliert, in dem mit Hilfe der RNA-Interferenz durch gezielten Abbau der entsprechenden mRNA die PP2Ca und PP2Cb spezifisch und gleichzeitig herunterreguliert werden konnten. Schließlich wurden die RNAi-Zellen während des Zeitfensters der Downregulation nach dem üblichen Protokoll mit Ölsäure behandelt: Verglichen mit der entsprechenden Kontrolle waren die SH-SY5Y-Zellen mit reduziertem PP2C-Gehalt weniger stark geschädigt. Die Proteinphosphatase 2C ist also an der ölsäureinduzierten Apoptose von SH-SY5Y-Zellen beteiligt; ihre Hemmung, sei es durch Knockdown oder Inhibitoren, reduziert den Zelltod und könnte damit eine Möglichkeit auch zum therapeutischen Eingriff bei Zuständen mit pathologisch gesteigerter Apoptose bieten.

Summary:
Imbalanced neuronal apoptosis is a cause of many diseases, like cancer, neurodegeneration and stroke. Therefore it is important to study the signaling pathways that are involved and to elucidate the underlying mechanisms to finally find a way to cure those diseases. The first focus of this study was to investigate neuroprotection mediated by Pifithrin alpha, an inhibitor of p53. In a rat model of transient global ischemia, pretreatment with 2 mg/kg Pifithrin alpha reduced damage of hippocampal CA1-neurons significantly. The main purpose of this thesis was to elucidate the role of protein phosphatase type-2C isoforms alpha and beta in oleic acid-induced apoptosis. These two isoforms of the magnesium-dependent serine/threonine phosphatase 2C have been shown to be activated in vitro by fatty acids with characteristic structural features. PP2C-activating oleic acid has additionally been shown to induce apoptosis in various systems. To find out whether or not there is a connection between those two events, a model was established in which oleic acid time- and concentration-dependently induces apoptosis in human neuroblastoma SH-SY5Y cells. Moreover, it was demonstrated, that PP2C-activating fatty acids induced apoptosis in SH-SY5Y cells as well as in cultured embryonical cortical neurons of rats, whereas non-activating ones did not. PP2C alpha can be found in the cytosol of SH-SY5Y cells. PP2C beta can additionally be detected in the nucleus. As shown by Western blotting and immunocytochemistry, oleic acid-treatment did not change the amount of PP2C in the cells. Proapoptotic Bad, which is an in vitro substrate of PP2C, is also located in the cytosol and may therefore be also an in vivo-substrate. Oleic acid-treatment did not change the amount of Bad protein in SH-SY5Y cells. Detection of phosphorylated Bad after oleic acid-induced apoptosis and subsequent immunoprecipitation did not show any change in protein levels. Thus, to show participitation of Bad in fatty acid-mediated apoptosis, further effort is necessary. As there are no specific inhibitors of PP2C available, RNA interference (RNAi) was used to knock down PP2C. Using this model it was possible to specifically reduce mRNA as well as protein levels for PP2C isoforms alpha and beta at the same time. Oleic acid-treatment of SH-SY5Y cells during downregulation of PP2C alpha and beta, respectively, led to less severe apoptotic damage as compared to cells with normal PP2C levels. These results suggest that PP2C is involved in oleic acid-induced apoptosis of SH-SH-SY5Y cells: Its downregulation attenuates cell death. Thus, inhibition of PP2C via knockdown or inhibitors might be a possibility to interfere in disesases based on increased apoptotic cell death.


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