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Titel:Kreatinstoffwechsel in humaner Haut
Autor:Lenz, Holger Janus
Weitere Beteiligte: Elsässer, Hans-Peter (Prof. Dr.)
Erscheinungsjahr:2004
URI:http://archiv.ub.uni-marburg.de/diss/z2004/0548
DOI: https://doi.org/10.17192/z2004.0548
URN: urn:nbn:de:hebis:04-z2004-05480
DDC: Medizin, Gesundheit
Titel(trans.):Creatine Metabolism in Human Skin

Dokument

Schlagwörter:
Ageing, Altern, Kreatinkinase, Creatine, Oxidativer Stress, Oxidative stress, Creatine kinase, Kreatin

Zusammenfassung:
Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurden verschiedene Aspekte des Kreatinmetabolismus in humaner Haut untersucht. Diese Aspekte waren im Einzelnen: Die zytosolische Kreatinkinase (CK-BB), die mitochondriale Kreatinkinase (CK-mt) sowie der Kreatintransporter (CT) konnten in humaner Haut immunhistologisch und mit Western-Blot-Analysen nachgewiesen werden. Ferner konnten die Lokalisation der CK-BB und CK-mt und die Funktionalität dieser Enzyme auch in vitro in primären, humanen Keratinozyten gezeigt werden. Zudem wurde die aktive Aufnahme von Kreatin in primären, humanen Keratinozyten und primären, humanen, dermalen Fibroblasten über den CT untersucht. Die Kreatinkinase-Aktivität wurde in primären, humanen Keratinozyten junger und alter Spender gemessen, wobei sich eine Reduktion der Aktivität im Verlauf des Alterungsprozesses zeigte. Dieser Reduktion konnte durch die Supplementation mit Kreatin ebenso entgegen gewirkt werden, wie der durch Wasserstoffperoxid verursachten Inhibition der Kreatinkinase-Aktivität. Somit konnte für Kreatin eine protektive Wirkung gegen oxidativen Stress, verursacht von vermehrt z.B. während des Alterungsprozesses auftretenden Reaktiven Sauerstoffspezies (ROS), gezeigt werden. Dieser Schutzeffekt kann durch die stabilisierende Wirkung von Kreatin auf CK-mt und damit auf die Mitochondrienmembran erklärt werden, da CK-mt die vorherrschende Isoform in Keratinozyten zu sein scheint. Die Schlüsselenzyme der Kreatinsynthese, Guanidinoacetat-Methyl-Trans-ferase (GAMT) und Arginin-Glycin-Amidino-Transferase (AGAT), konnten sowohl in humaner Haut als auch in primären, humanen Keratinozyten und primären, humanen, dermalen Fibroblasten auf mRNA Ebene nachgewiesen werden. Weiterhin zeigte sich bei Keratinozyten in vitro eine Stimulierbarkeit der Kreatinkinase-Aktivität nach Inkubation mit der Kreatinsynthesevorstufe Guanidinoacetat. Die Inhibition der CK-BB und CK-mt in Zellen der humanen Keratinozyten-Zelllinie HaCat und der humanen Gebärmutterhalskarzinom-Zelllinie HeLaS3 zeigt zum Teil drastische Auswirkungen auf die Zelle. Besonders die Inaktivierung der CK-mt führt zu deutlich zytotoxischen Effekten, verminderter Proliferation und einem Absinken des Mitochondrienmembranpotentials. Die Auswirkungen des Verlustes der CK-mt sind dabei auch elektronenmikroskopisch anhand von Veränderungen der Mitochon-drienmembranen zu sehen. In Bezug auf apoptotische und nekrotische Prozesse lässt sich jeweils bei Ausschalten der in dem Zelltyp geringer exprimierten Kreatinkinase der stärkere Anstieg beobachten. Die gewonnenen Daten zeigen nicht nur die Bedeutung der Kreatinkinasen für die Zelle auf, sondern unterstützen auch die Befunde zur besonderen Rolle der CK-mt bei der Stabilisierung der Mitochondrienmembran.

Summary:
Various aspects of the Creatine metabolism in human skin were researched within the framework of this study. These aspects are summarised as follows: The existence of cytoplasmic creatine kinase (CK-BB), mitochondrial creatine kinase (CK-mt) as well as a creatine transporter (CT) could be proven in the human skin immune-histologically and by western blot analysis. Furthermore, the localisation of the CK-BB and CK-mt and the functionality of these enzymes could be demonstrated in vitro in primary human keratinocytes. The active uptake of creatine in primary human keratinocytes and primary human dermal fibroblasts was investigated using the CT. Creatine kinase activity was measured in primary, human keratinocytes from old and young donors, and showed a reduction in the activity during the aging process. This reduction in the activity could be thwarted by creatine supplementation as could the inhibition of the creatine kinase activity caused by hydrogen peroxide. Therefore it was demonstrated that creatine exhibits a protective effect against oxidative stress, caused by an increase in reactive oxygen species (ROS) known to occur in the aging process. This protective effect can be explained by the stabilising property of creatine on the CK-mt and thus also on the mitochondrial membrane potential, as the CK-mt appears to be the predominantly occurring isoform in keratinocytes. The key enzymes of creatine synthesis: Guanidinoactate-Methyl-Transferase (GAMT) and Arginine-Glycine-Amidino-Transferase (AGAT) could be demonstrated in human skin, primary human keratinocytes and primary human dermal fibroblasts on mRNA level. Furthermore, the creatine kinase activity could be stimulated after incubation with the creatine synthesis precursor Guanidinoacetate in in vitro tests performed on keratinocytes. The inhibition of the CK-BB and CK-mt in cells of the human keratinocytic cell line HaCat and the human cervical carcinogenic cell line HeLa S3 showed, sometimes-drastic effects on the cells. Particularly the inactivation of the CK-mt leads to distinct cytotoxic effects, decreased proliferation and a reduction in the mitochondrial membrane potential. The results of a loss of the CK-mt can be observed electron microscopically on the basis of a change in mitochondrial membrane. An increase in the apoptotic and necrotic processes can be observed when the least expressed creatine kinase present in each of the cell lines was deactivated. The attained data shows, not only the relevance of the Creatine Kinases for the cell, but also supports the findings to the specialised role of the CK-mt in the stabilisation of the Mitochondrial membrane.


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