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Titel: Zu Komplex I verwandte Hydrogenasen in Carboxydothermus hydrogenoformans und Thermoanaerobacter tengcongensis
Autor: Soboh, Basem
Weitere Beteiligte: PD Dr. Hedderich, Reiner
Erscheinungsjahr: 2004
URI: https://archiv.ub.uni-marburg.de/diss/z2004/0539
URN: urn:nbn:de:hebis:04-z2004-05399
DOI: https://doi.org/10.17192/z2004.0539
DDC: Biowissenschaften, Biologie
Titel(trans.): Energy-Converting [NiFe] Hydrogenases from Extremophiles: Ancestors of ion-pumping NADH:quinone oxidoreductases?

Dokument

Schlagwörter:
[FeS] Protein, Ironsulfur protein, Kohlenmonoxid Dehydrogenase, Komplex I, Membrane-bound hydrogenase, Hydrogenase, [FeS] Protein, Hydrogenase, Kohlenmonoxid Dehydrogenase, Komplex I, Carbon monoxide dehydrogenase

Zusammenfassung:
Die Fähigkeit, Kohlenmonoxid unter anaeroben Bedingungen als Energiesubstrat zu nutzen, ist auf wenige Mikroorganismen beschränkt. Hierzu zählt das Gram-positive thermophile Bakterium Carboxydothermus hydrogenoformans. Die aus der Oxidation von Kohlenmonoxid stammenden Elektronen werden in diesem Organismus auf Protonen unter Bildung von Wasserstoff übertragen. CO + H2O è CO2 + H2 DG° = -20 kJ/mol Aus der Membranfraktion dieses Bakteriums wurde nach Solubilisierung mit dem Detergens Dodecyl-b-D-Maltosid ein Enzymkomplex, der als CO-oxidierender/H2-bildender Enzymkomplex bezeichnet wurde, gereinigt und charakterisiert. Mit 5% CO in der Gasphase katalysierte der Enzymkomplex die Umsetzung von CO zu CO2 und H2 mit einer spezifischen Aktivität von etwa 450 U (mg Protein)-1. Höhere CO-Konzentrationen in der Gasphase führten zur Hemmung der Hydrogenase im Enzymkomplex. Der Enzymkomplex konnte sowohl mit CO als auch mit einem starken Reduktionsmittel aktiviert werden. Der gereinigte Enzymkomplex bestand aus acht Untereinheiten, sechs hydrophilen und zwei hydrophoben Polypeptiden. Nach Bestimmung der aminoterminalen Sequenzen konnten die kodierenden Gene, die in zwei direkt aufeinander folgenden Genclustern lokalisiert sind, im vollständig sequenzierten Genom von Ca. hydrogenoformans identifiziert werden. Die biochemische Charakterisierung des Enzymkomplexes und eine Sequenzanalyse der Untereinheiten zeigten, dass der Enzymkomplex aus einer Ni-haltigen Kohlenmonoxid-Dehydrogenase und einer membranständigen [NiFe]-Hydrogenase zusammengesetzt ist. Die Kohlenmonoxid-Dehydrogenase besteht aus der katalytischen Untereinheit CooS und dem Elektronentransferprotein (Polyferredoxin) CooF. Die Hydrogenase setzt sich aus vier hydrophilen Proteinen und zwei integralen Membranproteinen zusammen. Diese besitzen eine hohe Sequenzverwandtschaft zu den korrespondierenden Untereinheiten einer zu Komplex I verwandten Gruppe von [NiFe]-Hydrogenasen. Da Ca. hydrogenoformans mit CO als alleinigem Energiesubstrat wachsen kann, muss die Umsetzung von CO zu CO2 und H2 mit einer Energiekonservierung gekoppelt sein. Es wird angenommen, dass die Hydrogenase in dem Enzymkomplex ähnlich wie Komplex I als Ionenpumpe ( H+ oder Na+) fungiert. Der zweite Teil der vorliegenden Arbeit zielte auf die Charakterisierung der Hydrogenasen in Ta. tengcongensis, einem thermophilen Gram-positives Bakterium, das Stärke oder Glukose zu Acetat, Ethanol, CO2 und H2 fermentiert. In dieser Arbeit wurde gezeigt, dass der Organismus eine einzigartige Kombination von zwei Hydrogenasen besitzt, die die Bildung von H2 während der Fermentation katalysieren. Beide Enzyme, eine Ferredoxin-abhängige membrangebundene-[NiFe]-Hydrogenase und eine heterotetramäre NADH-abhängige [FeFe]-Hydrogenase, wurden gereinigt und charakterisiert. Die membrangebundene Hydrogenase gehört ebenso wie die Hydrogenase aus C. hydrogenogformans zu einer Gruppe von zu Komplex I verwandten [NiFe]-Hydrogenasen. Als physiologisches Substrat dieser Hydrogenase konnte ein Ferredoxin identifiziert werden. Dieses Enzym katalysiert die H2-Bildung mit reduziertem Ferredoxin als Elektronendonor mit einer spezifischen Rate von 38 U (mg Protein)-1. Die aus der löslichen Fraktion von Ta. tengcongensis gereinigte Hydrogenase enthält FMN, mehrere Eisen-Schwefel-Zentren und zeigt im oxidierten Zustand ein EPR-Signal, das charakteristisch für das im aktiven Zentrum von [FeFe]-Hydrogenasen lokalisierte H-Cluster ist. Die biochemische Charakterisierung und Sequenzanalyse der Untereinheiten dieses Enzyms zeigten, dass es sich bei diesem Enzym um eine NADH-abhängige [FeFe]-Hydrogenase handelt. Wurde der H2-Partialdruck (p(H2)) in Ta. Tengcongensis-Kulturen durch Begasung des Fermenters mit N2 niedrig gehalten, wurde 1 mol Glucose zu 2 mol Acetat, 2 mol CO2 und 4 mol H2 umgesetzt. Wenn hingegen H2 in den Kulturen akkumulierte (Zucht in geschlossenen Flaschen), wurde die Fermentation teilweise in Richtung Ethanolbildung verschoben. Während die spezifische Aktivität der Ferredoxin-abhängigen [NiFe]-Hydrogenase nicht durch die Wachstumsbedingungen beeinflusst wurde, war die NAD(H)-abhängige [FeFe]-Hydrogenase-Aktivität etwa 4-fach höher in Zellextrakten aus Fermenter-Kulturen (niedriger p(H2)). Alkohol-Dehydrogenase- und Aldehyd-Dehydrogenase-Aktivitäten waren hingegen etwa 5fach höher in Zellextrakten aus Flaschenkulturen (hoher p(H2)). Dies deutet auf eine Regulation in Abhängigkeit von p(H2) hin.

Summary:
From the membrane fraction of the Gram-positive bacterium Carboxydothermus hydrogenoformans, an enzyme complex catalyzing the conversion of CO to CO2 and H2 was purified. The enzyme complex showed maximal CO-oxidizing:H2-evolving enzyme activity with 5% CO in the headspace (450 U per mg protein). Higher CO concentrations inhibited the hydrogenase present in the enzyme complex. For maximal activity, the enzyme complex had to be activated by either CO or strong reductants. The enzyme complex also catalyzed the CO- or H2-dependent reduction of methylviologen at 5900 and 180 U per mg protein, respectively. The complex was found to be composed of six hydrophilic and two hydrophobic polypeptides. The amino-terminal sequences of the six hydrophilic subunits were determined allowing the identification of the encoding genes in the preliminary genome sequence of C. hydrogenoformans. From the sequence analysis it was deduced that the enzyme complex is formed by a Ni-containing carbon monoxide dehydrogenase (CooS), an electron transfer protein containing four [4Fe4S] clusters (CooF) and a membrane bound [NiFe] hydrogenase composed of four hydrophilic subunits and two membrane integral subunits. The hydrogenase part of the complex shows high sequence similarity to members of a small group of [NiFe] hydrogenases with sequence similarity to energy conserving NADH:quinone oxidoreductases. The data support a model in which the enzyme complex is composed of two catalytic sites, a CO-oxidizing site and a H2-forming site, which are connected via a different ironsulfur cluster containing electron transfer subunits. The exergonic redox reaction catalyzed by the enzyme complex in vivo has to be coupled to energy conservation, most likely via the generation of a proton motive force. Thermoanaerobacter tengcongensis is a thermophilic Gram-positive bacterium able to dispose of the reducing equivalents generated during the fermentation of glucose to acetate and CO2 by reducing H+ to H2. A unique combination of hydrogenases, a ferredoxin-dependent [NiFe] hydrogenase and an NADH-dependent Fe-only hydrogenase, were found to be responsible for H2 formation in this organism. Both enzymes were purified and characterized. The tightly membrane-bound [NiFe] hydrogenase belongs to a small group of complex-I-related [NiFe] hydrogenases and has highest sequence similarity to energy-converting [NiFe] hydrogenase (Ech) from Methanosarcina barkeri. A ferredoxin isolated from Ta. tengcongensis was identified as the physiological substrate of this enzyme. The heterotetrameric Fe-only hydrogenase was isolated from the soluble fraction. It contained FMN and multiple iron sulfur clusters, and exhibited a typical H-cluster EPR signal after autooxidation. Sequence analysis predicted and kinetic studies confirmed that the enzyme is an NAD(H)-dependent Fe-only hydrogenase. When H2 was allowed to accumulate in the culture, the fermentation was partially shifted to ethanol production. In cells grown at high hydrogen partial pressure [p(H2)] the NADH-dependent hydrogenase activity was fourfold lower than in cells grown at low p(H2), whereas aldehyde dehydrogenase and alcohol dehydrogenase activities were higher in cells grown at elevated p(H2). These results indicate a regulation in response to the p(H2).


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