Zu Komplex I verwandte Hydrogenasen in Carboxydothermus hydrogenoformans und Thermoanaerobacter tengcongensis

Die Fähigkeit, Kohlenmonoxid unter anaeroben Bedingungen als Energiesubstrat zu nutzen, ist auf wenige Mikroorganismen beschränkt. Hierzu zählt das Gram-positive thermophile Bakterium Carboxydothermus hydrogenoformans. Die aus der Oxidation von Kohlenmonoxid stammenden Elektronen werden in diesem Or...

Ausführliche Beschreibung

Gespeichert in:
Bibliographische Detailangaben
1. Verfasser: Soboh, Basem
Beteiligte: PD Dr. Hedderich, Reiner (BetreuerIn (Doktorarbeit))
Format: Dissertation
Sprache:Deutsch
Veröffentlicht: Philipps-Universität Marburg 2004
Biologie
Schlagworte:
Online Zugang:PDF-Volltext
Tags: Tag hinzufügen
Keine Tags, Fügen Sie den ersten Tag hinzu!
Beschreibung
Zusammenfassung:Die Fähigkeit, Kohlenmonoxid unter anaeroben Bedingungen als Energiesubstrat zu nutzen, ist auf wenige Mikroorganismen beschränkt. Hierzu zählt das Gram-positive thermophile Bakterium Carboxydothermus hydrogenoformans. Die aus der Oxidation von Kohlenmonoxid stammenden Elektronen werden in diesem Organismus auf Protonen unter Bildung von Wasserstoff übertragen. CO + H2O è CO2 + H2 DG° = -20 kJ/mol Aus der Membranfraktion dieses Bakteriums wurde nach Solubilisierung mit dem Detergens Dodecyl-b-D-Maltosid ein Enzymkomplex, der als CO-oxidierender/H2-bildender Enzymkomplex bezeichnet wurde, gereinigt und charakterisiert. Mit 5% CO in der Gasphase katalysierte der Enzymkomplex die Umsetzung von CO zu CO2 und H2 mit einer spezifischen Aktivität von etwa 450 U (mg Protein)-1. Höhere CO-Konzentrationen in der Gasphase führten zur Hemmung der Hydrogenase im Enzymkomplex. Der Enzymkomplex konnte sowohl mit CO als auch mit einem starken Reduktionsmittel aktiviert werden. Der gereinigte Enzymkomplex bestand aus acht Untereinheiten, sechs hydrophilen und zwei hydrophoben Polypeptiden. Nach Bestimmung der aminoterminalen Sequenzen konnten die kodierenden Gene, die in zwei direkt aufeinander folgenden Genclustern lokalisiert sind, im vollständig sequenzierten Genom von Ca. hydrogenoformans identifiziert werden. Die biochemische Charakterisierung des Enzymkomplexes und eine Sequenzanalyse der Untereinheiten zeigten, dass der Enzymkomplex aus einer Ni-haltigen Kohlenmonoxid-Dehydrogenase und einer membranständigen [NiFe]-Hydrogenase zusammengesetzt ist. Die Kohlenmonoxid-Dehydrogenase besteht aus der katalytischen Untereinheit CooS und dem Elektronentransferprotein (Polyferredoxin) CooF. Die Hydrogenase setzt sich aus vier hydrophilen Proteinen und zwei integralen Membranproteinen zusammen. Diese besitzen eine hohe Sequenzverwandtschaft zu den korrespondierenden Untereinheiten einer zu Komplex I verwandten Gruppe von [NiFe]-Hydrogenasen. Da Ca. hydrogenoformans mit CO als alleinigem Energiesubstrat wachsen kann, muss die Umsetzung von CO zu CO2 und H2 mit einer Energiekonservierung gekoppelt sein. Es wird angenommen, dass die Hydrogenase in dem Enzymkomplex ähnlich wie Komplex I als Ionenpumpe ( H+ oder Na+) fungiert. Der zweite Teil der vorliegenden Arbeit zielte auf die Charakterisierung der Hydrogenasen in Ta. tengcongensis, einem thermophilen Gram-positives Bakterium, das Stärke oder Glukose zu Acetat, Ethanol, CO2 und H2 fermentiert. In dieser Arbeit wurde gezeigt, dass der Organismus eine einzigartige Kombination von zwei Hydrogenasen besitzt, die die Bildung von H2 während der Fermentation katalysieren. Beide Enzyme, eine Ferredoxin-abhängige membrangebundene-[NiFe]-Hydrogenase und eine heterotetramäre NADH-abhängige [FeFe]-Hydrogenase, wurden gereinigt und charakterisiert. Die membrangebundene Hydrogenase gehört ebenso wie die Hydrogenase aus C. hydrogenogformans zu einer Gruppe von zu Komplex I verwandten [NiFe]-Hydrogenasen. Als physiologisches Substrat dieser Hydrogenase konnte ein Ferredoxin identifiziert werden. Dieses Enzym katalysiert die H2-Bildung mit reduziertem Ferredoxin als Elektronendonor mit einer spezifischen Rate von 38 U (mg Protein)-1. Die aus der löslichen Fraktion von Ta. tengcongensis gereinigte Hydrogenase enthält FMN, mehrere Eisen-Schwefel-Zentren und zeigt im oxidierten Zustand ein EPR-Signal, das charakteristisch für das im aktiven Zentrum von [FeFe]-Hydrogenasen lokalisierte H-Cluster ist. Die biochemische Charakterisierung und Sequenzanalyse der Untereinheiten dieses Enzyms zeigten, dass es sich bei diesem Enzym um eine NADH-abhängige [FeFe]-Hydrogenase handelt. Wurde der H2-Partialdruck (p(H2)) in Ta. Tengcongensis-Kulturen durch Begasung des Fermenters mit N2 niedrig gehalten, wurde 1 mol Glucose zu 2 mol Acetat, 2 mol CO2 und 4 mol H2 umgesetzt. Wenn hingegen H2 in den Kulturen akkumulierte (Zucht in geschlossenen Flaschen), wurde die Fermentation teilweise in Richtung Ethanolbildung verschoben. Während die spezifische Aktivität der Ferredoxin-abhängigen [NiFe]-Hydrogenase nicht durch die Wachstumsbedingungen beeinflusst wurde, war die NAD(H)-abhängige [FeFe]-Hydrogenase-Aktivität etwa 4-fach höher in Zellextrakten aus Fermenter-Kulturen (niedriger p(H2)). Alkohol-Dehydrogenase- und Aldehyd-Dehydrogenase-Aktivitäten waren hingegen etwa 5fach höher in Zellextrakten aus Flaschenkulturen (hoher p(H2)). Dies deutet auf eine Regulation in Abhängigkeit von p(H2) hin.