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Titel: Regulation des Mais-induzierten mig2-Genclusters in Ustilago maydis
Autor: Farfsing, Jan W.
Weitere Beteiligte: Kahmann, Regine Prof. Dr.
Erscheinungsjahr: 2004
URI: https://archiv.ub.uni-marburg.de/diss/z2004/0537
DOI: https://doi.org/10.17192/z2004.0537
URN: urn:nbn:de:hebis:04-z2004-05377
DDC: Biowissenschaften, Biologie
Titel(trans.): Regulation of the maize-induced mig2 gene cluster in Ustilago maydis

Dokument

Schlagwörter:
Differential gene expression, Cis-aktive Elemente, Promoter analysis, Koregulation, Ustilago maydis, Cis-active elements, Phytopathogene Pilze, Co-regulation, Genregulation, Differentielle Genexpression, Ustilago maydis, Promotor, Promotoranalyse, Differentielle Genexpression

Zusammenfassung:
Der Erreger des Maisbeulenbrands, Ustilago maydis, induziert die Entwicklung von Tumoren bei der Maispflanze. Die pathogene Entwicklung von U. maydis beginnt mit der Fusion zweier kompatibler haploider Sporidien. Das entstehende dikaryotische Filament penetriert die Pflanzenoberfläche und proliferiert im Pflanzengewebe. In einem "differential-display"-Ansatz wurden Gene identifiziert, die ausschließlich während der biotrophen Phase exprimiert sind. Die fünf zueinander hoch homologen mig2-Gene sind in einem Gencluster angeordnet. Die ähnlichen Expressionsprofile lassen eine Koregulation aller mig2-Gene vermuten. Zur Untersuchung der Regulation wurde der am stärksten differentiell induzierte mig2-5-Promotor vor ein egfp-Reportergen kloniert, um in einer Mutationsanalyse cis-regulatorische Elemente zu identifizieren. Dabei konnte gezeigt werden, dass alle zur Expression notwendigen Elemente innerhalb der ersten 350 bp des mig2-5-Promotors lokalisiert sind. Die Basalpromotorsequenzen aller mig2-Gene sind hochkonserviert und besitzen ein Inr-Element mit zwei Haupttranskriptionsstartpunkten sowie eine TATA-ähnliche Box an vergleichbaren Positionen. Zudem ließen sich konservierte Bereiche identifizieren, die für die Induktion in der Pflanze notwendig sind. Hierfür verantwortliche cis-Elemente konnten in einem 70 bp umfassenden Bereich lokalisiert werden. Durch gezielte Mutationen von 5'-CCA-3'-Sequenzen und Konstruktion eines artifiziellen Promotors mit multiplen CCA-Motiven konnte gezeigt werden, dass diese Motive für die induzierbare Aktivität verantwortlich sind. Unter Berücksichtigung des Sequenzkontextes konnte für mig2-5 das 5'-CCAMC-3'-Motiv als potentielle Aktivatorbindesequenz abgeleitet werden. In der Genomsequenz von U. maydis konnte ein weiteres mig2-Homolog, mig2-6, identifiziert werden. Das mig2-6-Gen liegt auf einem anderen Chromosom als der mig2-Gencluster, weist aber ein ähnliches pflanzenspezifisches Expressionsprofil auf. Im Vergleich zu den mig2-Clustergenen ist mig2-6 in der Pflanze am stärksten induziert. Die vergleichende Analyse aller mig2-Promotoren, erlaubte die Ableitung eines Konsensusmotivs 5'-MNMNWNCCAMM-3', das in allen mig2-Promotoren gehäuft vorkommt. Außerdem konnte ein Zusammenhang zwischen der Stärke des Promotors, dem Vorliegen von Konsensusmotiven und ihren Abständen zueinander, sowie das Vorhandensein von konservierten Basalpromotorelementen hergestellt werden. Darüber hinaus gelang es potentielle mig2-Aktivatoren basierend auf den von ihnen erkannten Bindesequenzen einzugrenzen.

Summary:
The phytopathogenic fungus Ustilago maydis causes smut disease in its host plant maize. Pathogenic development starts with the fusion of two compatible haploid sporidia resulting in dikaryotic hyphae, which is infectious. U. maydis proliferates within plant tissue and triggers the formation of tumors on aerial parts. The U. maydis mig2 gene cluster comprises five highly homologous genes identified by a differential display approach. All genes display a pronounced plant specific expression profile, suggesting co-regulation. In order to identify cis-regulatory elements the promoter of the strongest differentially expressed gene, mig2-5, was subjected to a detailed mutation analysis. A 350 bp mig2-5 promoter fragment contained all elements sufficient to confer differential promoter activity. Further analysis of this region, fused to the green fluorescent protein (GFP) reporter gene, allowed dissecting core promoter elements (TATA-like and Inr elements), which strongly contribute to high-level promoter activity, from elements conferring inducible expression in planta. In particular, the presence of several 5 -CCA-3 motifs within a 70 bp stretch of the mig2-5 promoter was decisive for inducible promoter activity. On this basis an artificial promoter was reconstituted whose inducible activity specifically relied on multiple CCA motifs. Based on sequence comparison and mutation analysis within the critical 70 bp region, the 5'-CCAMC-3' consensus motif was derived representing a potential binding motif for the putative mig2-5 activator. In addition, a novel mig2 homologous gene, mig2-6, was identified that despite the fact that it is unlinked from the mig2 cluster displayed the strongest differential expression profile among mig2 genes. Comparative sequence analysis including the mig2-6 promoter revealed an over-representation of the consensus motif 5 -MNMNWNCCAMM-3 in all mig2 promoter sequences. This hypothesized that promoter strength correlates with number and arrangement of this consensus element as well as with the existence of conserved core promoter elements. Finally, potential mig2 activator candidate genes could be narrowed down based on their predicted recognition motifs.


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