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Titel: In vivo-Analysen zur Funktion bakterieller RNase P-Proteine in Bacillus subtilis
Autor: Gößringer, Markus
Weitere Beteiligte: Hartmann, Roland K. (Prof. Dr.)
Erscheinungsjahr: 2004
URI: https://archiv.ub.uni-marburg.de/diss/z2004/0529
URN: urn:nbn:de:hebis:04-z2004-05290
DOI: https://doi.org/10.17192/z2004.0529
DDC: 610 Medizin, Gesundheit
Titel(trans.): Genetic complementation in Bacillus subtilis for the study of bacterial RNase P proteins

Dokument

Schlagwörter:
RNase P, rnpA, Bacillus subtilis, Bacillus subtilis, Complementation, RNase P, Komplementation, rnpA

Zusammenfassung:
Das RNase P-Enzym katalysiert die Prozessierung der 5Ž-Enden aller tRNAs in der Zelle. Die bakterielle Endoribonuklease besteht aus einer katalytischen RNA-Untereinheit (kodiert von rnpB) und einer Proteinuntereinheit (kodiert von rnpA). Für Komplementations-Analysen wurde ein Bacillus subtilis-Stamm mit regulierbarer rnpA-Genexpression konstruiert. Hierfür wurde das chromosomale rnpA-Gen durch homologe Rekombination gegen ein rnpA-Gen mit Xylose-Promotor (Pxyl) ausgetauscht. Mittels RT-PCR-Analysen konnte gezeigt werden, daß die chromosomale rnpA-Expression in der konstruierten B. subtilis-Mutante effektiv inhibiert werden kann. Die Expression von rnpA wurde in Gegenwart von Xylose induziert. Der Wachstumsdefekt der Mutante in Abwesenheit von Xylose konnte durch plasmidkodiertes, homologes RNase P-Protein aufgehoben werden. Auf diese Weise konnte direkt in vivo gezeigt werden, daß das rnpA-Gen in B. subtilis essentiell ist. Mit dem B. subtilis-Stamm wurden anschließend heterologe Komplementationsstudien durchgeführt, um in vivo die Funktionalität von RNase P-Proteinen aus phylogenetisch entfernt verwandten Bakteriengattungen zu untersuchen. Die plasmidkodierten, heterologen RNase P-Proteine von Escherichia coli und Synechocystis sp. PCC6803 waren beide in der Lage, die essentiellen Funktionen des nativen RNase P-Proteins in B. subtilis zu ersetzen. Ferner konnte demonstriert werden, daß die B. subtilis-Mutante für die Überexpression und affinitätschromatographische Isolierung funktioneller, in vivo assemblierter RNase P genützt werden kann. Dies gelang durch die Transformation der Mutante mit einem Expressionsvektor, der sowohl für ein RNase P-Protein mit His-tag als auch für die RNase P-RNA kodiert.

Summary:
RNase P is responsible for the maturation of tRNA 5Ž termini. The bacterial endoribonuclease is composed of a catalytic RNA and a protein subunit. For complementation studies a Bacillus subtilis strain was constructed that expresses the protein subunit of the RNase P enzyme conditionally. For this purpose the chromosomal rnpA gene (encoding the RNase P protein subunit) was placed under the control of a xylose-promotor (Pxyl) by homologous recombination. RT-PCR analysis demonstrated that expression of rnpA was repressed in the constructed mutant strain efficiently and could be induced in the presence of xylose. In the absence of xylose, a plasmid-encoded homologous rnpA gene could rescue the lethal phenotype showing that the rnpA gene is essential in B. subtilis. Utilizing this strain, a heterologous complementation screen was initiated to compare the functionality of RNase P proteins from phylogenetically distant bacteria in vivo. The conditionally lethal phenotype of the constructed B. subtilis strain could be suppressed by plasmid-encoded RNase P proteins from Escherichia coli and Synechocystis sp. PCC6803. Furthermore, the mutant strain could be exploited to express plasmid-encoded His-tagged RNase P proteins, which provides a method for the isolation of in vivo assembled RNase P holoenzyme by affinity chromatography. Transformation of the mutant strain with an expression vector harbouring rnpA and rnpB (encoding the RNase P RNA subunit) enabled the over production of RNase P holoenzyme.


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