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Titel: Die Biosynthese cytotoxischer Lignane aus Linum nodiflorum L. (Linaceae): ß-Peltatin 6-O-Methyltransferase
Autor: Kranz, Kerstin
Weitere Beteiligte: Petersen, Maike (Prof. Dr.)
Erscheinungsjahr: 2004
URI: https://archiv.ub.uni-marburg.de/diss/z2004/0523
URN: urn:nbn:de:hebis:04-z2004-05232
DOI: https://doi.org/10.17192/z2004.0523
DDC: Medizin, Gesundheit
Titel(trans.): Biosynthesis of cytotoxic lignans from Linum nodiflorum L. (Lianaceae): ß-Peltatin 6-O-Methyltransferase

Dokument

Schlagwörter:
ß-Peltatin 6-O-Methyltransferase, Lignane, Methyltransferasen, Methyltransferase, Lignans

Zusammenfassung:
Lignane sind im Pflanzenreich weit verbreitete phenolische Sekundärstoffe, von denen Vertreter mit cytotoxischer, antimykotischer und antimikrobieller Wirkung bekannt sind. Das Aryltetralinlignan Podophyllotoxin, das aus Podophyllum peltatum oder Podophyllum hexandrum gewonnen wird, dient als Ausgangsstoff der semisynthetischen Krebs-medikamente Etoposid, Teniposid und Etopophos. Aber auch in Linaceae ist das Vorkommen von Aryltetralinlignanen, darunter auch Podophyllotoxin, bekannt. An Suspensionskulturen von Linum nodiflorum (Linaceae), in denen 6-Methoxypodophyllotoxin anstatt Podophyllotoxin als Endprodukt der Lignanbiosynthese vorkommt, soll der Syntheseweg der Aryltetralinlignane aufgeklärt werden. Ausgehend von ß-Peltatin soll die Methylierung zu ß-Peltatin-A Methylether gezeigt werden. In dieser Arbeit kann die ß-Peltatin 6-O-Methyltransferase (POMT) in Suspensionskulturen von Linum nodiflorum (Linaceae) erstmals nachgewiesen und beschrieben werden. Neben einem Enzymtest wird eine HPLC-Methode zur Auswertung etabliert. Die ß-Peltatin 6-O-Methyltransferase überträgt eine Methylgruppe von S-Adenosyl-L-methionin (SAM) auf ß Peltatin, wodurch der ß-Peltatin-A Methylether gebildet wird. Die Identität des Produkts wird über 1H- und 13C-NMR bestätigt. Das Enzym hat ein Temperaturoptimum von 40 °C und arbeitet optimal bei einem pH-Wert von 7,5 in 0,1 M Tris-HCl-Puffer. Für ß-Peltatin wurde ein apparenter Km-Wert von 40 µM und für SAM von 15 µM bestimmt. Bei Konzentrationen über 250 µM ß-Peltatin kann eine Substrathemmung beobachtet werden. Als weiteres Produkt der Methylierungsreaktion entsteht S Adenosylhomocystein (SAH), das auch eine Hemmung der POMT-Aktivität bewirkt. Diese Hemmung ist kompetitiv, kann also durch eine höhere Zugabe von SAM wieder aufgehoben werden. Die ß-Peltatin 6-O-Methyltransferase ist nicht abhängig von Magnesiumionen, wie es Caffeoyl-CoA Methyltransferasen sind. Es können keine Cofaktoren, aber Hemmstoffe der POMT-Aktivität gefunden werden. So hemmt Zinksulfat schon in einer Konzentration von 5 mM die POMT-Aktivität komplett. Auch Eisensulfat und Eisenchlorid hemmen in Konzentrationen von 5 mM die Aktivität bis auf 10 % der Ausgangsaktivität. Für Mangansulfat kann eine Hemmung bis auf 35 % bei Konzentrationen von 10 mM ermittelt werden. Über eine Größenausschlusschromatographie kann eine Größe von ca. 64 kDa ermittelt werden. Wie bei den meisten anderen pflanzlichen Methyltransferasen handelt es sich bei der POMT wahrscheinlich um ein Homodimer. Für die Reinigung der ß-Peltatin 6-O-Methyltransferase kann ein Protokoll ermittelt werden, bei dem eine fraktionierte Ammoniumsulfatfällung in einem Bereich von 40 80 % Ammoniumsulfatsättigung, eine Anionenaustauschchromatographie über Q-Sepharose, eine zweite Ammoniumsulfatfällung bis 80 % Ammoniumsulfatsättigung und eine Affinitäts-chromatographie über SAH-EAH-Sepharose aufeinanderfolgen. Damit kann ein Reinigungs-faktor von 12,6 fach erreicht werden, der Verlust der Aktivität liegt allerdings bei 92 %. Auf einem SDS-Polyacrylamidgel können nur noch wenige Proteinbanden nach der Affinitätschromatographie und damit ein deutlicher Reinigungseffekt gezeigt werden. Die Suspensionskultur von Linum nodiflorum wird über einen Zeitraum von 15 und 20 Tagen in Bezug auf Medienparameter wie Volumen, pH-Wert, Leitfähigkeit, Zuckergehalt und Konzentration an Ammonium, Phosphat und Nitrat beobachtet. Auch die Suspensionszellen können auf Proteingehalt, Enzymaktivität und Entwicklung des Frisch- und Trockengewichts untersucht werden. Aus den Zellen und dem Medium werden Lignane extrahiert und nach Art und Menge bestimmt. Mit degenerierten Primern gegen hochkonservierte Regionen von Methyltransferasen wie der SAM-Bindestelle werden über PCR methyltransferasenspezifische Amplifikate von cDNAs aus 6-Tage alten Zellen von Linum nodiflorum isoliert. Die cDNA-Stücke werden in E. coli einkloniert und nach Datenbankvergleich mittels der RACE-Methode bis zur kompletten Länge verlängert. Dabei wird die Methyltransferase MT 1 gefunden, die ein offenes Leseraster von 1095 Basen, codierend für ein Protein mit 365 Aminosäuren und einem berechneten Molekulargewicht von 39,8 kDa, besitzt. Sie hat bis ca. 80 % Identität mit Kaffeesäure 3-O-Methyltransferasen aus verschiedenen Pflanzenarten. Das vollstänige offene Leseraster der MT1-cDNA wird in den Expressionsvektor pTrc99a ligiert, und das Protein in E. coli JM 109 exprimiert. Das entstehende Protein wird auf Substratspezifität getestet. Dabei wird kein Umsatz von ß-Peltatin gemessen. Das exprimierte Enzym setzt Kaffeesäure und seine Derivate um. Der größte Umsatz kann jedoch mit dem Cumarin Daphnetin gemessen werden. Bei den umgesetzten Substraten kann eine gemeinsame Struktur entdeckt werden, die einen doppelt hydroxylierten Aromaten und einen größeren Rest enthält.

Summary:
Lignans are widely distributed phenolic compounds in the plant kingdom. Some of them have cytotoxic, antifungal and antimicrobial properties. The aryltetralin lignan podophyllotoxin is used as precursor for semisynthetic derivatives like Etoposide or Teniposide which are used in the treatment of cancer. Podophyllotoxin is isolated from Podophyllum plants but it can be found in different other plant families like Linaceae aswell. Other lignans like ß-peltatin or 6-methoxypodophyllotoxin can be isolated from Linum plants, too. Here the ß-peltatin 6-O-methyltransferase is isolated from Linum nodiflorum. The enzyme is purified and characterised. It is a S-adenosylmethionine (SAM)dependent enzyme that methylates ß-peltatin to ß-peltatin A-methylether. The pH-optimum is at 7.5 in 0.1 M Tris-HCl-buffer, the optimal incubation temperature is at 40 °C. An apparent Km-value of 40 µM for ß-peltatin as substrate and of 15 µM for SAM can be determined. For the purification of the enzyme an anion exchange an an affinity chromatography were used. Genes of different methyltransferases were tried to find by the use of degenerated primers. One methyltransferase could be ligated into the pTrc99a vector. The resulting protein was tested for putative substrates. The natural substrate could not be found so far, even if some substrates, mostly derivatives of caffeic acid, were methylated by the resulting methyltransferase.


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