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Titel:Oktaedrische vakuoläre Proteinkristalle in Phycomyces blakesleeanus: Biochemische und fluoreszenzspektroskopische Charakterisierung
Autor:Fries, Volker
Weitere Beteiligte: Galland, Paul (Prof. Dr.)
Erscheinungsjahr:2004
URI:http://archiv.ub.uni-marburg.de/diss/z2004/0517
URN: urn:nbn:de:hebis:04-z2004-05175
DOI: https://doi.org/10.17192/z2004.0517
DDC:570 Biowissenschaften, Biologie
Titel(trans.):Octahedral vacuolar protein crystals in Phycomyces blakesleeanus: biochemical and spectrofluorometric characterization

Dokument

Schlagwörter:
Statolith, Gravitropismus, Oktaedrische Proteinkristalle, Fluoreszenz, Fluorescence, Phycomyces blakesleeanus, Phycomyces, Octahedral protein crystals, Statolith, Gravitropism

Zusammenfassung:
Die negativ gravitropen Sporangiophoren des Zygomyceten Phycomyces blakesleeanus enthalten in ihrem zentralen Vakuolensystem parakristalline Proteinkörper. Diese sogenannten oktaedrischen Kristalle sedimentieren und zeigen eine passive Verlagerung nach Reorientierung der Sporangiophore im Raum. Aufgrund dessen wird ihre Funktion als Statolithen zur Graviperzeption diskutiert. Die Dichte der Kristalle variiert zwischen von 1,247 und 1,271 g cm-3. Isolierte Kristalle zeigen in der SDS-PAGE drei Proteine mit relativen Molekulargewichten von 16, 46,5 und 55 kDa. Diese Proteine finden sich nicht in Gravitropismus - Mutanten, welchen die Kristalle fehlen. Absorptionsspektren isolierter Kristalle deuteten auf die Anwesenheit von chromophoren Gruppen hin. Fluoreszensspektroskopische Untersuchungen bestätigten die Flavin- bzw. Pterin-Natur der mit den Kristallen assoziierten Chromophoren. Reduktion und Oxidation in vitro zeigten eine vom Redoxzustand abhängige Bindung der flavinartigen Chromophoren an die Kristalle. Bindungsstudien mit Riboflavin an isolierten Kristalle bestätigen dies und ergaben folgende Dissoziationskonstaten (KD, ox = 6x10-5M, KD, red = 2,8x10-5M). Ein einzelner Kristall (die durchschnittliche Höhe von WT-Kristallen betrug 3,91 µm und entsprach einem Volumen von 9,96 µm³) band etwa 106 flavinartige Pigmentmoleküle in reduziertem Zustand. Im Gegensatz dazu banden die pterinartigen Pigmente in oxidierter Form. Diese Redoxkombination der beiden Pigmente ermöglicht prinzipiell eine Elektronenübertragung zwischen den nicht-kovalent gebundenen Pigmenten (z. B. als Teilschritt einer Signaltransduktionskette). Fluoreszenzpolarisationsspektroskopie zeigte, dass die beiden Chromophore an die Proteinmatrix in nahezu paralleler Orientierung zueinander binden. Dies und die starke Überlappung der Fluoreszenzemissionsspektren der pterinartigen Chromophore und der Anregungspektren der flavinartigen Pigmente begünstigen eine strahlungslose Energieübertragung (Förstertransfer) vom pterin- auf das flavinartige Chromophor. Experimente zur gravitropen Beugung zeigten die untergeordnete Bedeutung der Statolithenfunktion der Kristalle im Gravitropismus im Vergleich zu den weiteren Gravisusceptionsmechanismen Zellwandbiegung und Auftrieb von Lipidglobuli. Stimulation der gravitropen Sporangiophorenbeugung durch tonisches Rotlicht zeigte eine Verrechnung von Photo- und Gravitropismus unter dem Einfluss der Kristall-Chromophore. Erste Befunde deuten auf eine Rolle von Ca2+ im Zusammenwirken mit den Kristallen für die Sporangiophorenbeugung hin. Dieser Hinweis wird gestützt durch Sequenzähnlichkeiten des 55 kDa-Kristall-Proteins mit in der Phototransduktion involvierten cGMP-gesteuerten Kanälen, einem calciumbindenden Protein sowie einer vakuolären ATPase. Sequenzübereinstimmungen mit schon bekannten Flavoproteinen konnten bisher noch nicht gefunden werden. Aufgrund ihrer Eigenschaften fungieren die oktaedrischen Kristalle von Phycomyces blakesleeanus über ihre Rolle als Statolithen hinaus wahrscheinlich als essentielle Elemente in der Verrechnung der Signaltransduktionswege von Photo- und Gravitropismus.

Summary:
The negatively gravitropic sporangiophores of the zygomycete Phycomyces blakesleeanus contain vacuolar paracrystalline protein bodies. These so-called octahedral crystals sediment and passively relocate upon reorientation of the sporangiophore. Therefore, a function as statoliths in gravisusception is currently discussed. The specific density of isolated crystals varies between 1,247 and 1,271 g cm-3. SDS-PAGE of purified crystals reveals three major proteins with relative molecular masses of 16, 46,5 and 55 kDa. These proteins are absent in gravitropic mutants which lack the crystals. Absorption spectra of suspensions of isolated crystals indicated the presence of chromphores. Spectrofluorometric data confirmed the flavin- or pterin-like nature, respectively, of the chromophores associated with the octahedral crystals. Reduction or oxidation in vitro revealed redox-dependent binding of the flavin-like chromophores to the crystal. Riboflavin bound with a KD, ox of 6x10-5M and a KD, red of 2,8x10-5M, respectively. The binding capacity of a single average crystal (the average height of wild-type crystals was 3,91 µm, corresponding to a volume of 9,96 µm³) was estimated about 106 pigment molecules. While flavin-like chromophores bound in the reduced form to the crystals, the pterin-like pigments bound in the oxidized form. This redox-combination raises the possibility electron transfer between the non-covalently bound chromophores, possibly as a step in the signal transduction chain. Fluorescence polarization spectra showed that the chromophores are arranged almost in parallel within the protein matrix of the crystal. This finding and the large overlap of the fluorescence emission spectrum of the pterin-like pigment(s) with the excitation spectrum of the flavin-like chromophore may well allow intermolecular energy (Förster) transfer. Studies on gravitropic bending suggested that the statolith function of the crystals is less important for gravisusception than two other stimuli, wall strain and lipid globules. However, stimulation of gravitropic bending by tonic red light in the presence of crystals with supportive spectral properties of the associated chromophores suggests an important function of the crystals for integration of the phototropic and gravitropic signaling pathways. First results indicate a role of Ca2+ on the bending of crystal-carrying sporangiophores. Support for this comes from sequence homologies of the crystal matrix protein (55 kDa) to a cGMP-regulated channel involved in phototransduction, to a calcium binding protein and to a vacuolar ATPase. So far, no sequence homologies to already known flavoproteins could be detected. The function of the octahedral crystals of Phycomyces blaskesleeanus appears not restricted to statolith function but rather the crystals have to be considered as essential elements for the integration of the signal transduction chains of gravitropism and phototropism.


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