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Titel:Zum Mechanismus der 2-Hydroxyglutaryl-CoA Dehydratase aus Clostridium symbiosum
Autor:Hetzel, Marc
Weitere Beteiligte: Buckel, Wolfgang
Erscheinungsjahr:2004
URI:http://archiv.ub.uni-marburg.de/diss/z2004/0514
URN: urn:nbn:de:hebis:04-z2004-05142
DOI: https://doi.org/10.17192/z2004.0514
DDC:570 Biowissenschaften, Biologie
Titel(trans.):The Mechanismn of the 2-Hydroxyglutaryl-CoA dehydratase of Clostridium symbiosum

Dokument

Schlagwörter:
2-Hydroxyglutaryl-CoA Dehydratase, 2-Hydroxyglutaryl-CoA dehydratase, Clostridium symbiosum, Clostridium symbiosum

Zusammenfassung:
Das 2-Hydroxyglutaryl-CoA-Dehydratase-System ist das Schlüsselenzym in der Fermentation von Glutamat zu Acetat, Butyrat, CO2 und H2 durch Clostridium symbiosum und Acidaminococcus fermentans. Die Dehydratase katalysiert die syn-Dehydratisierung von (R)-2-Hydroxyglutaryl-CoA zu (E)-Glutaconyl-CoA. Diese Dehydratisierung ist seit Jahren von großem mechanistischem Interesse, da ein nicht azides Proton (pKs = 40) am C-3 des (R)-2-Hydroxyglutaryl-CoA abstrahiert werden muss. In der vorliegenden Arbeit wurden biochemische und spektroskopische Untersuchungen dieses Enzymsystems bzw. Katalysemechanismuses durchgeführt, um weitere Einblicke in Reaktion und Elektronenfluss zu erhalten. Die Reinigungsmethoden für Komponente D aus Clostridium symbiosum wurden weiter verbessert und erneute Charakterisierungen der Kofaktoren durchgeführt. Trotz Hinweise auf eine Beteiligung eines d1-Metalls am Katalysemachanismus konnten nur Spuren (10 %) von Molybdän in Komponente D als auch ein nicht weiter identifizierter Molybdänkofaktor nachgewiesen werden. Durch die Einführung einer neuen Aktivitätsbestimmung der Komponente D konnte durch nicht-äquimolare Mischungen aus Komponente A und Komponente D der Beweis erbracht werden, dass nur substöchiometrische Mengen an Komponente A zur maximalen Aktivität gebraucht werden. Somit konnte gezeigt werden, dass es sich bei dem postulierten Mechanismus tatsächlich um einen katalytischen Mechanismus handelt. Durch die Bildung eines AlF4--induzierten Komplexes der Komponenten A und D in Anwesenheit von ATP konnte die Interaktion und den durch ATP-Hydrolyse getriebenen Elektronentransfer von Komponente A nach Komponente D gezeigt werden. Die bisher in der Komponente D gefundenen Kofaktoren ([4Fe-4S]2+Cluster und FMNH2) zeigen keine Änderungen ihrer Redoxzustände in Anwesenheit von Komponente A und ATP. Durch die erfolgreiche Kristallisation sowohl von Komponente D als auch von AlF4--induziertem Komplex der Komponenten A und D könnten nähere Informationen über Lage und Koordination der Kofaktoren zum aktiven Zentrum geben. Durch die Lösung der 3D-Struktur der b-Untereinheit der Komponente D konnte ein ungewöhnlicher [4Fe-4S]Cluster erkannt werden, der durch 3 Cysteine (Cys 74, 101 und 332) und 1 Tyrosin (Tyr 37) koordiniert ist. An dieser Koordination sind die drei strikt konservierten Cys-Reste der hgdB-Sequenz beteiligt. Der Tyr-Rest ist hingegen nicht konserviert und wird als Parkplatz des am postulierten Katalysemechanismus beteiligten Ketylradikals diskutiert.

Summary:
Several clostridia and fusobacteria ferment a-amino acids via (R)-2-hydroxyacyl-CoA, which is dehydrated to enoyl-CoA by syn-elimination. This reaction is of great mechanistic interest, since the b-hydrogen, to be eliminated as proton, is not activated (pK 40 50). A mechanism has been proposed, in which one high-energy electron acts as cofactor and transiently reduces the electrophilic thiol ester carbonyl to a nucleophilic ketyl radical anion. The 2-hydroxyacyl-CoA dehydratases are two-component systems composed of an extremely oxygen-sensitive component A, an activator, and component D, the actual dehydratase. Component A, a homodimer with one [4Fe 4S]cluster, transfers an electron to component D, a heterodimer with 1-2 [4Fe 4S]clusters and FMN, concomitant with hydrolysis of two ATP. From component D the electron is further transferred to the substrate, where it facilitates elimination of the hydroxyl group. In the resulting enoyradical the b-hydrogen is activated (pK Œ 14). After elimination the electron is handed-over to the next incoming substrate without further hydrolysis of ATP. The helix cluster helix architecture of component A forms an angle of 105_, which probably opens to 180_ upon binding of ATP resembling an archer shooting arrows. Therefore we designated component A as Archerase . Here, we describe 2-hydroxyglutaryl-CoA dehydratase from Acidaminococcus fermentans, Clostridium symbiosum and Fusobacterium nucleatum, 2-phenyllactate dehydratase from Clostridium sporogenes, 2-hydroxyisocaproyl-CoA dehydratase from Clostridium di.cile, and lactyl-CoA dehydratase from Clostridium propionicum. A relative of the 2-hydroxyacyl-CoA dehydratases is benzoyl-CoA reductase from Thauera aromatica. Analogous but unrelated archerases are the iron proteins of nitrogenase and bacterial protochlorophyllide reductase. In anaerobic organisms, which do not oxidize 2-oxo acids, a second energy-driven electron transfer from NADH to ferredoxin, the electron donor of component A, has been established. The transfer is catalysed by a membrane-bound NADH ferredoxin oxidoreductase driven by an electrochemical Naþ-gradient. This enzyme is related to the Rnf proteins involved in Rhodobacter capsulatus nitrogen fixation.


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