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Titel: Genexpression während des täglichen Torpors: Molekulare Mechanismen der Stoffwechseldepression
Autor: Berriel Díaz, Mauricio
Weitere Beteiligte: Prof. Dr. Gerhard Heldmaier
Erscheinungsjahr: 2004
URI: https://archiv.ub.uni-marburg.de/diss/z2004/0513
DOI: https://doi.org/10.17192/z2004.0513
URN: urn:nbn:de:hebis:04-z2004-05130
DDC: Biowissenschaften, Biologie
Titel(trans.): Gene expression during daily torpor: molecular mechanisms of metabolic depression

Dokument

Schlagwörter:
Dsungarischer Zwerghamster, Tagesschlaflethargie, täglicher Torpor, Torpor <Zoologie>, Translation, Transkription <Genetik>, Stoffwechseldepression, Hypometabolism, Metabolic depression, Translation <Genetik>, Transcription, Hypometabolismus, Djungarian Hamster, Daily torpor

Zusammenfassung:
Dsungarische Zwerghamster (Phodopus sungorus) zeigen täglichen Torpor als Teil ihrer saisonalen Akklimatisation an die kalte Jahreszeit. Wie viele andere Kleinsäuger senken die Hamster während des Torpors ihre Stoffwechselrate zur Energieeinsparung während der täglichen Ruhephase für mehrere Stunden ab. Die verringerte Eigenwärmeproduktion führt in Abhängigkeit von der Umgebungstemperatur zu einer Erniedrigung der Körpertemperatur (Hypothermie). Verantwortlich für den Eintritt in den hypometabolen Zustand während des täglichen Torpors ist ähnlich wie beim Winterschlaf eine Stoffwechseldepression. Im Mittelpunkt der vorliegenden Arbeit standen Untersuchungen zur Genexpression beim Eintritt in den täglichen Torpor. Dabei lag das Interesse sowohl auf der Identifikation differentiell exprimierter Gene, als auch auf der Untersuchung der globalen Transkriptions- und Translationsaktivität, die einen Beitrag zur metabolischen Depression leisten könnten. Die kontinuierliche Messung der Stoffwechselrate mittels indirekter Kalorimetrie ermöglichte die Gewebeentnahme in drei metabolischen Zuständen: Normometabol (Kontrollen), torpid (bei Erreichen der minimalen Stoffwechselrate) und nach dem Erwachen aus dem Torpor (Arousal). Die globale Transkriptionsaktivität in der Leber wurde mittels Transcriptional Run on Assays untersucht. Bei Zellkernen aus der Leber torpider Hamster konnte im Vergleich zu den normometabolen Kontrollen ein um ~40% erniedrigter Einbau radioaktiv-markierter Nukleotide in die in vitro-transkribierten mRNA-Moleküle festgestellt werden. Dies lässt auf eine Reduktion der Initiationsrate von Transkriptionsvorgängen während des Torpors schließen. Die in vitro- Transkriptionsrate der Leber-Zellkerne von Hamstern, die aus dem Torpor wieder erwacht waren (Arousal), unterschied sich nicht von den Proben der normometabolen Kontrolltiere. Zum Vergleich der Proteinsynthese in der Leber normometaboler und torpider Hamster wurden Polysomen-Profile erstellt. Im Gegensatz zu den Proben normometaboler Hamster, bei denen die Ribosomen vorwiegend in Form von Polysomen vorlagen, konnte bei den Proben torpider Hamster ein Zerfall von Polysomen beobachtet werden. Die Disaggregation von Polysomen lieferte einen Hinweis auf eine reduzierte Proteinsynthese während des Torpors. Bei Transkription und Translation handelt es sich um energieaufwendige Prozesse, die zusammen über 30% der in Form von ATP fixierten Energie beanspruchen. In der Leber, die für ~20% der Basalstoffwechselrate verantwortlich ist, konnte nachgewiesen werden, dass die Inhibition der Synthese von RNA und Protein einen wesentlichen Mechanismus der Stoffwechseldepression beim Eintritt in den täglichen Torpor darstellt. Mittels Northernblot-Analysen wurde die mRNA-Expression von drei Isoenzymen der Pyruvat-Dehydrogenase-Kinase (PDK 1, 2 und 4) im Herzmuskel normometaboler und torpider Hamster untersucht. Die Kinasen inaktivieren durch Phosphorylierung den Pyruvat-Dehydrogenase-Komplex (PDC), was zur Umschaltung von Glucose-Verwertung auf Fettsäuren als primäres Substrat zur Energiegewinnung führt. In einer früheren Studie konnte beim Dsungarischen Zwerghamster eine positive Korrelation zwischen der Stoffwechselrate der Tiere und der Aktivität des PDC u.a. im Herzmuskel festgestellt werden, was auf eine Inaktivierung des Multienzymkomplexes während des täglichen Torpors schließen lässt. Für PDK4 konnte eine leichte Erhöhung der mRNA-Konzentration im Herzmuskel torpider Hamster im Vergleich zu normometabolen Kontrollen festgestellt werden, die jedoch nicht in einer Erhöhung des PDK4-Proteingehalts resultierte. 48-stündiger Futterentzug hingegen hatte eine drastische Erhöhung der PDK4-mRNA-Konzentration zur Folge. Die in früheren Studien an Winterschläfern beobachtete Erhöhung der PDK4-Expression im Herzmuskel könnte eine Anpassung an das chronische Fasten während des Winterschlafs darstellen. Im Gegensatz dazu kommt es während des täglichen Torpors bei Dsungarischen Zwerghamstern nicht zu langfristigem Futterentzug. Sie sind auch im Winter auf eine regelmäßige Nahrungszufuhr angewiesen. Die kurzfristige Regulation der PDKs könnte auf allosterische Effektoren zurückzuführen sein. Als nicht-hypothesenbasierende Ansätze zur Identifikation von im Herzmuskel differentiell exprimierten Genen während des Torpors wurden zwei alternative Methoden verwendet. Bei der cDNA-RDA basierte die Differenzanalyse auf einer subtraktiven Hybridisierung und anschließender selektiver Amplifikation von cDNA-Fragmenten. Alternativ zur cDNA-RDA wurden Maus-Filterarrays zur Identifikation von Unterschieden in der Genexpression eingesetzt. Bei keinem der selektierten Kandidaten konnte die differentielle Genexpression auf Northernblots bestätigt werden. Eine metabolische Reorganisation auf der Grundlage differentieller Genexpression scheint im Herzmuskel nicht zu den zentralen Mechanismen der metabolischen Depression beim Einritt in den täglichen Torpor zu zählen.

Summary:
Djungarian hamsters display daily torpor spontaneously as part of their seasonal acclimation to winter conditions, providing a strategy to cope with limited food availability and cold. The torpid state during the daily period of rest is characterized by a decrease of metabolic rate resulting in a reduction of energy expenditure. Similar to hibernation, the entrance into the hypometabolic state involves an active metabolic depression that precedes the development of hypothermia. The present thesis is focused on analyses of gene expression during the entrance into daily torpor, in order to identify differentially expressed genes as well as changes in the global transcriptional and translational activity contributing to the observed metabolic depression. Metabolic rate was measured continuously using indirect calorimetry. Tissues were sampled in defined metabolic states: during normometabolism (controls), in the torpid state (when minimal metabolic rate was first attained during entrance into torpor), and after arousal from torpor. Transcriptional run-on assays were employed to investigate the status of transcriptional initiation as a function of the torpid state. The determination of the in vitro transcription rate in isolated nuclei reflects a snapshot of global transcriptional activity in a given physiological state. Nuclei were isolated from liver tissue of normometabolic, torpid and aroused hamsters and subjected to nuclear run-on assays at a temperature of 25°C. A ~40% decrease in transcriptional initiation was observed in liver nuclei of hamsters which had attained minimal metabolic rate during torpor as compared to nuclei from normometabolic hamsters. During arousal from torpor, the transcriptional run-on activity recovered to the normometabolic level. Polysome profile analysis of liver tissue was used to determine the proportion of actively translating polysomes. Profiles of liver samples from torpid animals show a disaggregation of polysomes compared to profiles from normometabolic hamsters, which indicates that, in addition to transcription, protein synthesis decreases during torpor. These results indicate that during torpor a specific inhibition of the energetically costly processes of RNA and protein synthesis contribute to the overall metabolic depression. As candidates for differentially expressed genes during torpor, the mRNA expression of three isoenzymes of the pyruvate dehydrogenase kinase (PDK1, 2 and 4) were analysed in the heart of normometabolic and torpid hamsters using Northernblots. The kinases inactivate the pyruvate dehydrogenase complex (PDC) by reversible phosphorylation. PDC catalyzes the conversion of pyruvate to acetyl-CoA and is therefore a key enzyme responsible for the entry of carbon units into the tricarboxylic acid cycle. Inactivation of PDC leads to an inhibition of glucose oxidation and favours the utilization of lipids as a metabolic fuel. A previous study revealed a positive correlation between PDC activity and metabolic rate, suggesting a role of pyruvate dehydrogenase complex (PDC) inactivation in the selection of metabolic fuel during daily torpor. A weak increase in the concentration of PDK4 mRNA in the heart of torpid hamsters was observed as compared to normometabolic controls. However, this increase did not result in an altered amount of PDK4 protein in the heart of torpid hamsters. An ~10-fold increase in the mRNA encoding PDK4 occurred in the heart of hamsters after 48 h of food deprivation. The expression of PDK4 during fasting is comparable to the seasonal increase of PDK4 in the heart of hibernating ground squirrels, suggesting that this effect is due to long-term food deprivation during hibernation. Winter acclimated Djungarian hamsters display daily torpor spontaneously, without anticipatory development of starvation symptoms, even when fed ad libitum. Despite the energy savings due to daily torpor, they still rely on continuous feeding during winter. Short-term regulation of PDK activity during daily torpor could be based on allosteric effectors more than on the level of gene expression. Two alternative methods were applied to identify differentially expressed genes in the heart during daily torpor. The cDNA-RDA is based on a subtractive hybridization and a subsequent selective amplification of cDNA-fragments representing differentially expressed transcripts. In addition, mouse Unigene filterarrays were hybridized with cDNA from normometabolic and torpid hamsters. Both experiments resulted in a set of candidate genes that appear to differ between the normometabolic and the torpid state, but none could be confirmed as differentially expressed on Northernblots. The entrance into the torpid state seems not to be the result of major changes in gene expression. Rapid and reversible mechanisms like protein phosphorylation are more likely responsible for the metabolic depression during torpor, enabling cells to resume normal function after arousal from torpor.


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