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Titel: Microparticular and Nanoparticular DNA Delivery Systems as Adjuvants for DNA Immunization
Autor: Oster, Christine
Weitere Beteiligte: Kissel, Thomas (Professor Dr.)
Erscheinungsjahr: 2004
URI: https://archiv.ub.uni-marburg.de/diss/z2004/0493
URN: urn:nbn:de:hebis:04-z2004-04936
DOI: https://doi.org/10.17192/z2004.0493
DDC: Medizin, Gesundheit
Titel(trans.): Microparticular and Nanoparticular DNA Delivery Systems as Adjuvants for DNA Immunization

Dokument

Schlagwörter:
Zerstäubungstrocknung, Polymere, Nano-Carrier, Biologisch abbaubarer Kunststoff, DNS, Sprühtrocknung, Mikropartikel, Nano-carriers, Adjuvantien, Imunization, Nanoparticles, Transfektion, Biodegradable polymers, DNA Delivery, Nanopartikel, Gentransfer

Zusammenfassung:
In this dissertation different microparticular and nanoparticular DNA carrier systems were developed, with the aim to create an efficient adjuvant system for DNA vaccination. Their suitability was investigated by physico-chemical parameters, such as particle size, z-potential and encapsulation efficiency. Further, the systems were studied in-vitro for DNA stabilization and DNA bioactivity after encapsulation and release, as well as for gene delivery. We investigated modified double emulsion methods and spray drying techniques for DNA microencapsulation. Firstly, DNA was complexed with polyethylenimine (PEI) 25 kDa. We further studied the possibility to encapsulate lyophilized DNA and lyophilized DNA / PEI complexes in the presence of lyoprotectants. The microparticles were formulated using i) a modified double emulsion technique (W/O/W), ii) a solid in oil in water method (S/O/W), iii) a water in oil spray drying technique (W/O) and iv) a solid in oil spray drying technique (S/O). DNA release from particles prepared with double-emulsion methods, in contrast to spray drying techniques, resulted in constant DNA release and relatively low initial burst effects. The complexation with PEI substantially retarded the DNA release for all preparation techniques. In Chapter 4, we adsorbed DNA onto the surface of microparticles. We developed a cationic microparticular system by the incorporation of different amounts of the cationic molecules, PEI or CTAB into the polyester matrix. PEI 10% microparticles exhibited the most promising characteristics, such as a small particle size, a high z-potential of + 47 mV, a high DNA adsorption efficiency for a theoretical loading of 1% over the physiological pH range. The mechanism of gene delivery was studied by confocal microscopy and revealed diffuse fluorescence of DNA and PEI in the cytoplasm of non-phagocytic L929 fibroblasts. This was attributed to polyplex formation after PEI release from the particle. The efficient gene transfer of RG 502H+PEI 10% microparticles was confirmed by luciferase transfection. The challenge experiments with a lethal dose of the pathogen in challenge experiments in mice demonstrated that the formulation had an adjuvant effect. In Chapter 5, a new polymeric system was designed, consisting of poly (vinyl-alcohol) coupled with diamines, such as diethylaminopropylamine (DEAPA), (DMAPA) or (DEAEA). The amphiphilic properties allowed the formulation of DNA nanoparticles by a modified solvent displacement technique without the use of shear forces. DNA nanoparticles exhibited positive z-potentials up to +42 mV. The gene delivery of the nanoparticles was assessed in L929 mouse fibroblasts, which demonstrated high transfection efficiencies, comparable to PEI 25kDa/DNA complexes at a nitrogen to phosphate ratio of 5. In Chapter 6 we chose one representative polymer, P(26)-10, of the new class of amine-modified polyesters to investigate the influence of several process parameters on the nanoparticle formation. In Chapter 7, DNA nanoparticles with amine-modified polyesters were further characterized using two classes of polymers (DEAPA /DEAEA) with different amounts of amine modifications. The nanoparticle x-potentials and sizes were dependent on the N/P ratio. Atomic force microscopy confirmed the small particle sizes. DNA stability during the encapsulation process and release over nine day was demonstrated by electrophoresis, as well as DNA protection from enzyme degradation in dependence of the N/P ratio. The amount of cellular uptake of an efficient candidate P(68)-10, DNA nanoparticles was shown to be dependent on the N/P ratio of the formulation by flow cytometry. The mechanism of cellular uptake was followed by confocal microscopy and exhibited endocytotic uptake of the particles. The very efficient gene delivery of the P(68)-10 polymer was demonstrated by in-vitro transfection assays in four cell lines compared to PEI / DNA complexes at equal N/P ratios.

Summary:
In dieser Arbeit wurden mikropartikuläre und nanopartikuläre DNA-Trägersysteme mit dem Ziel einer adjuvanten Anwendung für DNA-Impfstoffe entwickelt. Deren Eignung wurde anhand physikalisch-chemischer Parameter charakterisiert. In Kapitel 3 haben wir das Doppelemulsionsverfahren und die Sprühtrocknung zur Herstellung von DNA-Mikropartikeln untersucht. Die DNA wurde in Lösung, als Polyethylenimin (PEI) 25 kDa Komplex, sowie in lyophilisierter Form in Anwesenheit von Lyoprotektoren verkapselt. Folgende Methoden zur Herstellung der DNA Mikropartikel wurden verwendet: (1) ein modifiziertes Doppelemulsions-verfahren (W/O/W), (2) ein Feststoff in Öl in Wasser Verfahren (S/O/W), (3) die Sprühtrocknung einer Wasser in Öl Dispersion (W/O) und (4) die Sprühtrocknung einer Feststoff in Öl Dispersion (S/O). Die Partikel aus dem Doppelemulsions-verfahren setzten DNA kontinuierlich frei, wohingegen die DNA aus sprühgetrockneten Mikropartikeln primär schlagartig freigesetzt wurde. Durch die Komplexierung mit PEI konnte die DNA-Freisetzung in allen Zubereitungen erheblich verlangsamt werden. In Kapitel 4 haben wir DNA an Oberflächen von Mikropartikeln adsorbiert. Durch die Integration unterschiedlicher Anteile kationischer Moleküle PEI oder CTAB in Polyestergerüste konnten wir Mikropartikel mit kationischen Oberflächeneigenschaften entwickeln. Partikel mit 10% PEI zeichneten sich durch besonders positive Eigenschaften, wie zum Beispiel einer geringen Partikelgröße, eines positiven x-Potentials von +47 mV und einer besonders guten DNA-Adsorptionseffizienz über den physiologischen pH-Bereich, aus. Konfokale Aufnahmen mit fluoreszenz-markierten PEI - Partikeln und DNA resultierten in diffuser Fluoreszenz im Zytoplasma von nicht-phagozytischen L929 Fibroblasten. Dies wurde auf das Herauslösen von PEI und der Bildung von Polyplexen zurückgeführt. Der Gen-Transfer der RG 502H+PEI 10% Partikel konnte des weiteren durch die Transfektion mit dem Reportergen Luciferase bestätigt werden. Daher setzten wir diese Partikel als Trägersystem für die DNA-Immunisierung von Mäusen gegen Listeria monocytogenes ein In Kapitel 5 wurde die Entwicklung eines neuen Polymersystems für die Verkapselung von DNA beschreiben. Diese Polymere wurden aus Poly-(vinyl-alkohol) und Diamin-Substituenten Diethylaminopropylamin (DEAPA), DMAPA oder DEAEA aufgebaut. Diese Polymer-Rückgrate wurden mit Seitenketten aus D,L-Laktid und Glykolid (50:50) aus 10 oder 20 Monomeren gepfropft.. Die amphiphilen Polymer-eigenschaften ermöglichten es, ein neues Verfahren zu Verkapselung von DNA zu ohne Verwendung von Scherkräften zu entwickeln. In Kapitel 6 wählten wir ein repräsentatives Polymer dieser neuen Polymerklasse, P(26)-10, um die Prozessparameter des Herstellungsverfahrens der DNA Nanopartikel zu charakterisieren. In Kapitel 7 wurden die neuartigen Polymersysteme durch die Formulierung von DNA Nanopartikeln in unterschiedlichen N/P Verhältnissen charakterisiert und in-vitro angewendet. Die Raster-Kraft-Mikroskopie konnte die gemessenen Partikelgrößen bestätigen. Durch Flow Cytometrie mit P(68)-10 DNA Nanopartikeln konnte gezeigt werden, dass die Partikelaufnahme in Zellen vom N/P Verhältnis abhängig ist. Der entsprechende Aufnahmemechanismus wurde mit Hilfe der konfokalen Mikroskopie verfolgt. Die Aufnahme der Partikel in das endo/lysosomale Kompartiment und eine Freisetzung des kovalent gebundenen Polymerlabels in das Cytosol konnte beobachtet werden. Wir nehmen daher eine Freisetzung der Formulierung aus Endosomen durch einen osmotischen Effekt der PLGA Abbauprodukte in Kombination mit polykationischen Eigenschaften des Rückgrates an. Die ausgesprochen gute Transfektionseffizienz eines der Polymere, P(68)-10, wurde in unterschiedlichen N/P Verhältnissen und in vier Zelllinien untersucht und war bei gleichen N/P Verhältnissen vergleichbar mit PEI / DNA Komplexen.


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