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Titel:Untersuchungen zur Rolle von Cytochrom P450-Enzymen in der Biosynthese von Aryltetralin-Lignanen in Zellkulturen von Linum spec.
Autor:Kuhlmann, Stephan
Weitere Beteiligte: Petersen, Maike (Professor Dr.)
Erscheinungsjahr:2004
URI:http://archiv.ub.uni-marburg.de/diss/z2004/0485
URN: urn:nbn:de:hebis:04-z2004-04855
DOI: https://doi.org/10.17192/z2004.0485
DDC: Medizin, Gesundheit
Titel(trans.):Investigations about the role of cytochrome P450-enzymes in the biosynthesis of aryltetralin-lignans in cell cultures of linum spec.

Dokument

Schlagwörter:
Podophyllotoxinderivate, Lignane, Zellkultur, Lein, Cytochrome P450, Podophyllotoxin, Linum nodiflorum, Lignans, Cytochrom P-450, Desoxypodophyllotxin

Zusammenfassung:
Lignane sind phenolische Verbindungen des pflanzliche Sekundärstoffwechsels, die sich von der Aminosäure Phenylalanin ableiten, über das Pflanzenreich weit verbreitet sind und die vielfältige pharmazeutisch-medizinische Bedeutungen haben können. Podophyllotoxin (PTOX), ein Aryltetralin-Lignan, ist stark cytotoxisch und dient u.a. als Ausgangs-substanz der halbsynthetischen Glycoside Etoposid und Teniposid, die als Chemotherapeutika eingesetzt werden. Wildsammlungen von Podophyllum spec. stellen momentan die hauptsächliche Bezugsquelle für Podophyllotoxin dar. Außerdem konnten Aryltetralin-Lignane auch in einigen Leinarten (Linum spec.) nachgewiesen werden. In der vorliegenden Arbeit werden Untersuchungen zur Biosynthese von Lignanen wie PTOX oder 6-Methoxypodophyllotoxin (MPTOX) in Suspensionskulturen von Linum album, L. flavum und L. nodiflorum beschrieben. Ein besonderer Schwerpunkt der Arbeit liegt auf der Rolle beschriebener oder vermuteter Cytochrom P450-abhängiger Oxygenasen, einer Enzymklasse, die viele oxidative Reaktionen im pflanzlichen Sekundärstoffwechsel katalysiert. Biotransformationsversuche in L. nodiflorum deuten darauf hin, dass der Umsatz von Desoxypodophyllotoxin (DOP) zu PTOX durch eine DOP7H Cytochrom P450-abhängig sein könnte, da er durch den spezifischen Inhibitor Tetcyclacis gehemmt wird. In Mikrosomen-präparationen aus Linum nodiflorum war keine DOP7H-Aktivität nachweisbar. Die kürzlich in L. flavum beschriebene Desoxypodophyllotoxin 6-Hydroxylase (DOP6H), die den Umsatz von DOP zu -Peltatin katalysiert, konnte in Zellkulturen von L. nodiflorum nachgewiesen und in zellfreien Extrakten charakterisiert werden. Ihre höchste Aktivität weist die DOP6H aus L. nodiflorum bei pH 7,4 und etwa 35 °C auf. Die hemmende Wirkung verschiedener Cytochrom P450-spezifischer Inhibitoren, wie Cytochrom c oder Tetcyclacis wurde gezeigt. Außerdem konnten hemmende Effekte des Substratanalogons 4’-Demethyl-DOP, sowie divalenter Kationen, insbesondere Mn2+ festgestellt werden. Als Km-Werte für das Substrat Desoxypodophyllotoxin (DOP) und das Cosubstrat NADPH wurden 8,3 µM und 47 µM ermittelt. Die Bedeutung des alternativen Cosubstrats NADH wurde untersucht, wobei kein synergistischer (überadditiver) Effekt festgestellt werden konnte, wie er von vielen tierischen und humanen Cytochrom P450-Systemen bekannt ist. Die geringe Enzymaktivität mit NADH verweist auf eine mögliche Beteiligung von Cytochrom b5 an der Elektronen-transport-kette zur DOP6H in vitro. Außerdem werden Ansätze zur biotechnologischen Verwendbarkeit der DOP6H, wie die Verwendung von Zn/Co(III)-Sepulchrat als alternative Elektronendonatoren anstelle von NADPH und eine Aufreinigungsstrategie über eine Affinitäts-chromato-graphie mit Hilfe des Substratanalogons 4’-Demethyl-DOP diskutiert. Yatein gilt als mögliche direkte Vorstufe von DOP in der Lignan-Biosynthese. Ein Umsatz von Yatein zu DOP, wie in Podophyllum spec. beschrieben, konnte in den untersuchten Zellkulturen nicht nachgewiesen werden. Dies kann als Hinweis darauf gewertet werden, dass die Biosynthesewege in den Gattungen Linum und Podophyllum unterschiedlich verlaufen könnten. Die mögliche Bedeutung von Yatein wird diskutiert. Zusätzlich wurde damit begonnen NADPH:Cytochrom P450-Reduktasen (CPR) aus den genannten Zellkulturen zu klonieren. Für den Ablauf Cytochrom P450-abhängiger Reaktionen sind diese Reduktasen als Elektronendonatoren notwendig. Durch RT-PCR konnten mit Hilfe genspezifischer Primer Teilklone für CPRs aus L. album, L. flavum und L. nodiflorum isoliert werden. DOP scheint ein Verzweigungspunkt in der Lignan-Biosynthese zu sein, da es eine Vorstufe sowohl von PTOX als auch MPTOX ist. Das genauere Verständnis der enzymatischen Umsetzung von DOP ermöglicht eine Abschätzung des bio-techno-logischen Potentials der Lignan-Biosynthese in Zellkulturen von Linum spec.

Summary:
Lignans, phenolic compounds of plant secondary metabolism, are derived from the aminoacid phenylalanin and are widely distributed throughout the plant kingdom. Podophyllotoxin (PTOX), an aryltetralin-lignan, is highly cytotoxic and of medicinal interest, because semisynthetic glycosides like etopiside and teniposide are derived from it. Podophyllum plants, collected in the wild, are the most important source of podophyllotoxin today. Podophyllotoxin-like lignans were also found in some linum species. In this thesis, studies about the biosynthesis of lignans like PTOX and 6-mezhoxypodophyllotoxin (MPTOX)in suspension cultures of linum nodiflorum, linum flavum and linum album are described. The main focus is on the role of cytochrome p450 monooxygenases, a class of enzymes that can catalyze a lot of oxidative reactions in plant secondary metabolism. Biotransformation experiments in l. nodiflorum gave hints, that the formation of PTOX from desoxypodophyllotoxin (DOP), catalyzed by a DOP7H, could be cytochrome p450 dependent, because it was specifically inhibited by tetcyclacis. In microsomal preparations from l. nodiflorum DOP7H activity was not detectable. The desoxypodophyllotoxin 6-hydroxylase (DOP6H), recently described in l. flavum, could be detected in suspension cultures of l. nodiflorum and characterised in cell free extracts. Temperature and pH-optima were at 35 °C and pH 7.4, respectively. The inhibitory effect of different substances, like the known cytochrome p450-specific inhibitors cytochrome c and tetcyclacis, the substrate-analogon 4'-demethyl-DOP and divalent cations, espacially Mn2+ was shown. The Km-values of DOP and NADPH were determined as 8,3 µM and 47 µM, respectively. No synergistic effect, as known from animal and human systems, could be found with the alternative cosubstrate NADH. This could be due to a possible participation of cytochrome b5 in the electron transport chain to DOP6H in vitro. The biotechnological potential of DOP6H was investigated by the use of Zn/Co(III)-sepulchrate as alternative electron donor. A purification strategy via affinity chromatography with 4'-demethyl-DOP is discussed. Yatein is a possible precursor of DOP in lignan-biosynthesis. A turnover of Yatein to DOP, as described in podophyllum spec., could not be detected in the examined cell cultures. This may be due to the fact, that the biosynthetic routes in the genera podophyllum and linum are different. The possible role of yatein is discussed. Additionally, cloning of NADPH:cytochrome P450-reductases (CPRs) from the mentioned cell cultures was started. Via RT-PCR subclones of CPRs from l. album, l. flavum and l. nodiflorum were isolated. DOP seems to be a branching point in lignan-biosynthesis, because it is a precursor of PTOX and MPTOX alike. A better understanding of enzymatic turmover of DOP allows for an estimation of the biotechnological potential of the lignan-biosynthesis in linum cell cultures.


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