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Titel:Identifizierung neuer Kerndomänen assoziierter Proteine
Autor:Fleischer, Sandra
Weitere Beteiligte: Lingelbach, Klaus (Prof.)
Erscheinungsjahr:2004
URI:http://archiv.ub.uni-marburg.de/diss/z2004/0438
URN: urn:nbn:de:hebis:04-z2004-04380
DOI: https://doi.org/10.17192/z2004.0438
DDC: Biowissenschaften, Biologie
Titel(trans.):Identification novel nuclear body associated proteins

Dokument

Schlagwörter:
Nucleolus, Zellkern, RNA binding protein, Nucleolus, Kernproteine, PML-Kerndomänen, Transcription factor, Nuclear domain, PML body, Transkriptionsfaktor, RNS-Bindungsproteine, KRAB-C2H2-Zinkfingerprotein

Zusammenfassung:
Der Zellkern eukaryotischer Zellen zeichnet sich durch zahlreiche morphologisch sowie funktionell unterschiedliche Domänen aus, die als Kernkompartimente bezeichnet werden. Zu ihnen gehören u. a. der Nukleolus und die Promyelozytische Leukämie (PML) Protein Kerndomänen, die als dynamische subnukleäre Strukturen bei der Regulation des Zellzyklus, der Apoptose, der Transkription, der Tumorsuppression und der zellulären, antiviralen Antwort eine wichtige Bedeutung besitzen. Die Funktion sowie die Regulation der in Kerndomänen ablaufenden Prozesse sind gegenwärtig weitgehend nur unzureichend verstanden. Ziel dieser Dissertation war es, neue Kerndomänen-assoziierte Komponenten zu identifizieren und zu charakterisieren. Diese Studien sollten zu einem besseren Verständnis der Funktion von Kerndomänen beitragen. Zu diesem Zweck wurden neue, nicht charakterisierte proteinkodierende Abschnitte von in Sequenzdatenbanken bis zu diesem Zeitpunkt nicht annotierten cDNAs an EYFP fusioniert, in humanen Zelllinien exprimiert und auf ihre subzelluläre Lokalisation analysiert. Zwei dieser neuen Proteine konnten aufgrund ihrer Lokalisation als neue Kerndomänen-assoziierte Komponenten identifiziert werden. Bei einem der beiden Proteine, dem PAROT (PML-associated repressor of transcription)-Protein, handelt es sich um einen Repressor der Transkription, der eine N-terminale Repressordomäne, eine KRAB- (Krüppel associated box) Domäne, eine Linker-Domäne und eine C-terminale C2H2-Zinkfinger (ZNF)-Domäne zur DNA-Bindung, sowie drei Konsensus- Kernlokalisationssignale (NLS) besitzt. Anhand seiner Domänenstruktur konnte PAROT der ZNF91-Proteinfamilie der multiple-adjacent -KRAB-C2H2-Zinkfinger Proteine zugeordnet und das zugehörige Gen, ebenso wie die meisten anderen Mitglieder der ZNF91-Proteinfamilie, auf dem Chromosom 19p13.11 kartiert werden. Die PAROT mRNA konnte in verschiedenen menschlichen Geweben wie Skelettmuskel, Niere, Dickdarm und Gehirn als ein 4.4 kb Transkript nachgewiesen werden. Ektopisch exprimiertes PAROT-Protein lokalisiert in Kerndomänen und kann durch die PML-Isoform IV in PML-Kerndomänen rekrutiert werden. Weiterhin kolokalisiert es mit dem Korepressor TIF1b sowie mit Mitgliedern der Heterochromatin Protein 1 (HP1)-Proteinfamilie, was vermuten lässt, dass das PAROT-Protein, ähnlich wie andere KRAB-ZNF Repressoren, über die direkte Interaktion mit TIF1b die Genexpression reprimiert. Die Repression der Transkription durch das PAROT-Protein kann aufgrund der Rekrutierung durch die PML-Isoform PML IV in PML-Kerdomänen dosisabhängig aufgehoben werden. Somit handelt es sich bei PAROT um einen durch seine Assoziation mit PML-Kerndomänen regulierbaren Transkriptionsrepressor. Indirekte Immunfluoreszenzanalysen mit unterschiedlichen gegen das PAROT-Protein gerichteten Antikörpern zeigten unerwarteterweise eine Kolokalisation von PAROT mit Mitochondrien, was als Hinweis verstanden werden kann, dass PAROT nur auf bestimmte Stimuli hin in den Zellkern einwandert und seine Zielgene reprimiert. Das zweite identifizierte Kerndomänenprotein, Nucleostatmin, besitzt zwei putative NLS, eine mögliche Nukleoluslokalisierungssequenz (NoLS) und ein RNA-Erkennungsmotiv (RRM), das dieses Protein als ein RNA-bindendes Protein klassifiziert. Nucleostatmin ist ein in Maus und Ratte konserviertes Protein und zeigt eine starke Sequenzhomologie zum Protein aus Maus und Ratte, die besonders in den Bereichen des RRM und der möglichen NoLS ausgeprägt sind. Ektopisch exprimiertes Nucleostatmin lokalisierte überwiegend im Nukleoplasma, war jedoch auch im Nukleolus nachweisbar. Endogenes Nucleostatmin Protein ist zusammen mit der DNA-abhängigen RNA Polymerase I und dem UBF Protein in fibrillären Zentren des Nukleolus lokalisiert. Wurde die DNA-abhängige RNA-Synthese der RNA Pol I durch AMD inhibiert, lokalisierte Nucleostatmin nicht mehr im Nukleolus, sondern war diffus im Nukleoplasma verteilt. Demnach übt Nucleostatmin möglicherweise eine Funktion auf transkriptioneller oder post-transkriptioneller Ebene der rRNA Transkription aus. Zwei neue, unbekannte Kerndomänen-assoziierten Proteine konnten mithilfe dieses methodischen Lösungsansatzes identifiziert und charakterisiert wurden. Es stellte sich im Laufe dieser Arbeit heraus, dass dabei die Lokalisation der EYFP-Fusionsproteine nicht zwingend der des endogenen Proteins entspricht, was erstmals eine Schwachstelle dieses Ansatzes zur Identifizierung neuer Kerndomänenkomponenten aufzeigt. Dennoch bestätigte sich für PAROT als ersten Vertreter der KRAB-C2H2-Zinkfinger Proteinfamilie nachweislich eine PML-Kerndomänen Assoziation. Interessanterweise wurde auch ein weiteres KRAB-C2H2-Zinkfinger, KRIM1A, von PML IV in PML-Kerndomänen rekrutiert. Eine PML-Kerndomänen Assoziation von Nucleostatmin bleibt zu analysieren. Mit großer Wahrscheinlichkeit handelt es sich hierbei um ein neues RNA-bindendes, nukleoläres Protein, das eine noch unbekannte Funktion in der rRNA Transkription ausübt.

Summary:
The eukaryotic cell nucleus posesses multiple morphologically and functionally different domains called nuclear compartments. Some of these nuclear compartments are e. g. the nucleolus and promyelocytic leukemia (PML) protein nuclear domains, which are dynamic subnuclear structures that play an important role in regulation of cell cycle, apoptosis, transcriptional regulation, tumor suppression and cellular antiviral response. The function as well as the regulation of processes emanating from these nuclear domains are not clearly understood so far. The aim of this dissertation was to identify and chracterize novel nuclear body associated proteins. These studies should allow a more detailed understanding of the function of nuclear domains. In order to identify novel nuclear-dot localized proteins a straight foreward approach using the specific, dot-like nuclear localisation of so far not annotaded GFP-fused full length cDNAs has been chosen. Two of these proteins have been characerized as novel nuclear domain assoziated components. One of the proteins, PAROT (PML-associated repressor of transcription)-protein, is a transcriptional repressor protein. It posesses a N-terminal repressor domain, a KRAB- (Krüppel associated box) domain, a linker-domain and a C-terminal C2H2-zincfinger (ZNF)-domain for DNA-binding, as well as three consensus-nuclear localization signals. Due to its domain structure PAROT belongs to the ZNF91-proteinfamily of "multiple-adjacent"-KRAB-C2H2-zinkfinger proteins, whereas the corresponding gene is lokalized on chromosome 19p13.11 as well as several other family members of the ZNF91-proteinfamily. PAROT mRNA was shown to be expressed as a 4.4 kb transcript in different human tissues like sceletal muscle, kidney, colon and brain. Ectopic expressed PAROT-protein localizes in nuclear domains and can be recruited through PML isoform PML IV in PML nuclear bodies. Furthermore it colocalizes with the corepressor TIF1b as well as members of heterochromatin protein 1 (HP1)-proteinfamily. PAROT seems to repress gene expression via a direct interaction with TIF1b as well as several other KRAB-ZNF repressor proteins. Recruitment of PAROT in PML bodies through PML IV leads to a dosisdependent modulation of PAROT-mediated transcriptional repression. Thus PAROT is a PML-body associated and due to that an adjustable transcriptional repressor. anti-PAROT antibodies used in indirect immunofluorescent studies showed an unexpected mitochondrial localization of PAROT. This might be a hint that PAROT localizes to the nucleus only after a special stimulus to repress its target genes. The second identified nuclear protein, Nucleostatmin, posesses two putative nuclear localization signals, a possible nucleolus localization sequence (NoLS) and a RNA-recognition motif (RRM). Thus Nucleostatmin is a RNA-binding protein. Nucleostatmin is highly conserved in mouse and rat and shows strong sequence homology in the RRM-containing part and in the C-terminal part harbouring the putative NoLS. Ectopic expressed Nucleostatmin localizes mostly to the nucleoplasm but also in part in nucleoli. The endogenous protein localizes together with RNA polymerase I and Upstream Binding Factor in fibrillar centres of nucleoli. Inhibition of DNA-dependent RNA sythesis by RNA polymerase I using Actinomycin D results in a diffuse distribution of Nucleostatmin in the nucleoplasma. Thus Nucleostatmin has a possible transcriptional or post-transcriptional function in rRNA transcription. In summary two novel and unknown nuclear domain-associated proteins have been identified an characterizes with this experimental study. During the study it has been shown that localization of EYFP-fusionproteins not always corresponds to localization of endogenous proteins. Nevertheless for the PAROT protein as the first member of KRAB-C2H2 zincfinger proteins a PML-body association has been shown. Interestingly a second KRAB-C2H2, KRIM1A, is also recruited to PML bodies by PML IV. A PML-body association of Nucleostatmin still has to be investigated. This protein is probably a novel RNA-binding, nucleolar protein with a so far unknown function in rRNA transcription.


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