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Titel: Neuroprotektion durch Nikotin, Clenbuterol, Memantin und Prolin-reiches Peptid in einer Primärkultur von postnatalen Hippocampuszellen der Ratte
Autor: Kremers, Wolfram-Alexander
Weitere Beteiligte: Krieglstein, Josef (Prof. Dr. Dr.)
Erscheinungsjahr: 2004
URI: https://archiv.ub.uni-marburg.de/diss/z2004/0435
DOI: https://doi.org/10.17192/z2004.0435
URN: urn:nbn:de:hebis:04-z2004-04355
DDC: 610 Medizin, Gesundheit
Titel(trans.): Neuroprotection induced by Nicotine, Clenbuterol, Memantine and Proline-rich Peptide in a primary culture of postnatal hippocampal cells from rats

Dokument

Schlagwörter:

Zusammenfassung:
Die durch Nikotin und Nikotinrezeptoragonisten (Epibatidine, ABT-494) vermittelte Neuroprotektion beruht u.a. auf der vermehrten Expression der mRNA von bFGF und einer vermehrten Expression von bFGF [6], [28]. Sowohl in-vitro als auch in-vivo konnte keine Beteiligung des Wachstumsfaktors TGF-ß1 an der durch Nikotin vermittelten Neuroprotektion nachgewiesen werden. In einer postnatalen, hippocampalen Mischkultur wurde keine Regulation der mRNA-Menge und der Proteinmenge von TGF-ß1 gesehen. Auch bei der histologischen Färbung der Gehirnschnitte auf TGF-ß1 konnte keine Beeinflussung der Proteinmenge durch Nikotintartrat in den verschiedenen Hirnarealen (Hippocampus, Cortex, Striatum) nachgewiesen werden, so dass man zusammenfassend sagen kann, dass Nikotin eine neuroprotektive Wirkung besitzt, diese aber nicht durch den Wachstumsfaktor TGF-ß1 ausgelöst wird. Diese Neuroprotektion könnte auf einer Induktion von anderen Wachstumsfaktoren, z.B. bFGF beruhen. Dies ist das gleiche Prinzip wie bei der Neuroprotektion, die durch das ß2-Sympathomimetikum Clenbuterol ausgelöst wird. Clenbuterol wirkt über eine Induktion von Wachstumsfaktoren (NGF, bFGF, TFG-ß1) [12], [17], [15] neuroprotektiv gegenüber einem durch Glutamat induziertem exzitatorischen Zelltod, aber auch gegenüber einem durch Staurosporin induzierten apoptotischen Zelltod. Ebenso kann durch Clenbuterol das Infarktvolumen nach einer cerebralen Ischämie reduziert werden. Die Kombination aus dem ß2-Sympathomimetikum Clenbuterol und dem NMDA-Rezeptorantagonisten Memantin wurde in-vivo und in-vitro auf die neuroprotektive Wirkung untersucht. Dabei konnte nachgewiesen werden, dass sowohl in-vivo als auch in-vitro die Kombination dieser beiden Pharmaka in der Lage ist, eine stärkere Neuroprotektion zu vermitteln, als durch die Gabe dieser Substanzen alleine erreicht werden kann. In-vitro konnte durch die Kombination von 10 nM Clenbuterol mit 10 nM Memantin eine stärkere Reduktion des Anteils der apoptotischen Zellen an der Gesamtzellzahl nach Inkubation mit Staurosporin beobachtet werden als durch Clenbuterol bzw. Memantin alleine erreicht werden konnte. Ebenso kann durch die Kombination in einer Konzentration von 1 nM Clenbuterol mit 1 nM Memantin eine stärkere Neuroprotektion gegenüber einem durch Glutamat ausgelösten nekrotischen Zelltod erreicht werden. Bei vielen Arzneistoffen gibt es das Phänomen, dass nur ein Enantiomer des Racemats wirksam ist, d.h. es gibt ein Eutomer (wirksame Enantiomer) und ein Distomer (unwirksames Enantiomer). In den Untersuchungen konnte sowohl in-vivo als auch in-vitro nachgewiesen werden, dass das (+)-Enantiomer neuroprotektiv wirksam ist. Sowohl gegenüber einem apoptotischen als auch einem nekrotischen Zelltod wirkt das (+)-Enantiomer neuroprotektiv. Allerdings trägt das (-)-Enantiomer nicht zur neuroprotektiven Wirkung des Clenbuterols bei. Das (+)-Enantiomer bewirkt in einer Dosierung von 0,3 mg/kg KG und 1,0 mg/kg KG eine Reduktion des Infarktvolumens nach einer cerebralen Ischämie an Mäusen. Es konnten aber keine Unterschiede in dem Ausmaß der NGF-Expression und der Astrozytenaktivierung durch die Enantiomere festgestellt werden. Eine Neuroprotektion kann nicht nur durch Nikotintartrat, Clenbuterolhydrochlorid oder Memantinhydrochlorid erreicht werden, sondern auch durch PRP. Durch die Vorbehandlung einer postnatalen, hippocampalen Mischkultur mit PRP über 8 h in einer Konzentration von 10-5 g/ml konnte eine neuroprotektive Wirkung nachgewiesen werden. Ein Vergleich von PRP und Vasopressin war nötig, da sich gezeigt hat, dass das Peptid PRP in einem hohen prozentualen Anteil mit der Struktur des Vasopressins übereinstimmt. Diese Neuroprotektion konnte durch Vasopressin unter denselben Bedingungen nicht erreicht werden. Über den genauen Wirkmechanismus des Peptids konnten keine Aussagen gemacht werden. Hierfür wäre eine ICC nötig, um zu erkennen, ob dieses Peptid in die Zelle aufgenommen wird. Wenn es in die Zelle gelangen würde, wäre es wichtig zu wissen, wo dieses Peptid in der Zelle lokalisiert ist, ob es im Kern vorhanden ist, oder im Cytosol. Diese Untersuchungen konnten leider nicht durchgeführt werden, da der monoklonale Antikörper gegen dieses Peptid nicht spezifisch ist. Sowohl beim Dot-Blot als auch im Western-Blot zeigten sich eine Reihe unspezifischer Signale.

Summary:
It is known that nicotine and nicotinereceptoragonists (Epibatidine, ABT-494) induce neuroprotection by induction of bFGF mRNA and bFGF protein. In the present study no changes in the expression of the growth factor TGF-ß1 caused by nicotine were seen in vivo and in vitro. In postnatal hippocampal cells nicotine did not influence the expression of the TGF-ß1 mRNA or the TGF-ß1 protein. We also could not see any influence of nicotinetartrat on the expression of TGF-ß1 in different brain regions (hippocampus, cortex, striatum) after immunhistochemical staining. Nicotine and nicotinereceptoragonists did not influence the level of mRNA and of protein of TGF-ß1. Clenbuterol is neuroprotective by induction of growth factors like NGF, bFGF or TGF-ß1. Clenbuterol protected cells against apoptosis induced by staurosporine and necrosis induced by glutamate. The infarct volume after cerebral ischemia in mice could also be reduced by clenbuterol. The combination of the ß2-adrenergic agonist clenbuterol and the NMDA-receptor antagonist memantine were examined regarding the neuroprotective effect in vivo and in vitro. In vivo and in vitro the combination of these drugs was more neuroprotective than the single drug alone. In a postnatal hippocampal cell culture the concentrations of 10 nM clenbuterol and 10 nM memantine were more protective than 10 nM clenbuterol or memantine alone against an apoptotic cell death. The combination of 1 nM clenbuterol and memantine was more protective against the necrotic cell death than each drug alone. Usually one enantiomere of the racemate mediates the pharmacological effect. The enantiomere, which shows an effect, is called eutomere, the other one is called distomere. In vivo and in vitro the (+)-enantiomere of clenbuterol was neuroprotective. The (-)-enatiomere showed no protective effect. In a postnatal hippocampal cell culture only the (+)-enantiomere is neuroprotective against an apoptotic and necrotic cell death. In vivo the dosis of 0.3 and 1.0 mg/kg body weight (+)-clenbuterol reduced the infarct volume after cerebral ischemia in mice. In vitro no differences in activation of astroctyts and expression of NGF could be seen between both the enantiomeres. Neuroprotection could also be reached by proline-rich peptide (PRP). A primary culture of postnatal hippocampal cells was pretreated for 8 h with 10-5 g/ml PRP. After their pretreatment apoptotic cell death was induced by staurosporine. Under these conditions this peptide was protective against an apoptotic cell death. PRP has a structure similar to vasopressin. However, vasopressin was not neuroprotective under these conditions. Studies on the mechanism of neuroprotection of PRP were performed. It was of interest to study, where this peptide was localized in the cell. Is this peptide localized in the cytosol or in the nucleus? For these studies immunocytochemical analysis should have been used. Moreover the monoclonal antibody against this peptide was not specific enough. In a Western-Blot, a lot of unspecific signals were detected.


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