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Titel:The Role of Chemokines in Leukocyte Recruitment across the Blood-Brain Barrier
Autor:Alt, Carsten
Weitere Beteiligte: Engelhardt, Britta (Prof.)
Erscheinungsjahr:2004
URI:http://archiv.ub.uni-marburg.de/diss/z2004/0352
DOI: https://doi.org/10.17192/z2004.0352
URN: urn:nbn:de:hebis:04-z2004-03526
DDC:610 Medizin, Gesundheit
Titel(trans.):Die Rolle von Chemokinen bei der Rekrutierung von Leukozyten durch die Blut-Hirn-Schranke

Dokument

Schlagwörter:
BBB, BHS, Chemokine, EAE, EAE

Summary:
Migration of autoaggressive T cells across the blood-brain barrier (BBB) is critically involved in the initiation of multiple sclerosis (MS) and its animal model experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE). The direct involvement of chemokines in this process was suggested by our recent observation that G-protein-mediated signaling is required to promote adhesion strengthening of encephalitogenic T cells on BBB endothelium in vivo. For chemokines to be involved in this process, they have to be either expressed by BBB endothelial cells themselves or would require a yet unknown transport mechanism from the central nervous system (CNS) parenchyma across the endothelial BBB to the luminal surface of the endothelial cells. To search for chemokines expressed by the endothelial BBB itself, in situ hybridizations and immunohistochemistry were performed and expression of the lymphoid chemokines CCL19 and CCL21 was found in venules surrounded by inflammatory cells. Their expression was paralleled by the presence of their common receptor CCR7 in inflammatory cells in brain and spinal cord sections of mice afflicted with EAE. Encephalitogenic T cells showed surface expression of CCR7 and the alternative receptor for CCL21, CXCR3. They specifically chemotaxed towards both CCL19 or CCL21 in a concentration dependent and pertussis toxin-sensitive manner comparable to naive lymphocytes in vitro. Functional involvement of CCL19 and CCL21 in adhesion strengthening of encephalitogenic T lymphocytes was demonstrated by binding assays on frozen brain sections of mice afflicted with EAE in vitro and preliminary by intravital fluorescence videomicroscopy in spinal cord of healthy mice in vivo. The moderate effect observed suggests additional, potentially unknown chemokines to be involved in lymphocyte recruitment across the endothelial BBB into the immunoprivileged CNS. Such chemokines, receptors as well as unknown molecules were identified at the level of the endothelial BBB by oligonucleotide microarrays, subtractive suppression hybridization (SSH) and proteomics. Besides the upregulation of expected genes and proteins described to be involved in leukocyte recruitment during EAE pathogenesis before, unexpected genes and proteins were identified. The latter included increased Duffy antigen / receptor for chemokines (DARC) expression suggesting its involvement in lymphocyte recruitment during EAE pathogenesis, which was proven as in DARC-deficient mice, disease onset was delayed, while clinical severity was increased. This may be explained by an ambiguous DARC function in EAE pathogenesis. Either endothelial cell expressed DARC "shuttles" chemokines to the luminal surface of the endothelial cells or erythrocyte expressed DARC removes chemokines by its "sink"-like function. This results in either increased or decreased chemokine concentrations accessible to encephalitogenic T lymphoblasts. Their encephalitogenicity was addressed by gene array analysis and SSH of encephalitogenic versus non-encephalitogenic T lymphoblasts identifying 79 differentially expressed genes. Based on the results obtained during this thesis, we would like to suggest the lymphoid chemokines CCL19 and CCL21 to be critically involved in lymphocyte recruitment across the endothelial BBB during EAE pathogenesis, while the chemokine receptor DARC may provide a "shuttle" mechanism for inflammatory chemokines from the CNS parenchyma across the endothelial BBB to the luminal surface of the endothelial cells during EAE. A large number of additional genes and proteins was identified to be differentially expressed in either endothelial cells or T lymphoblasts pointing to new mechanisms involved in leukocyte trafficking across the BBB.

Zusammenfassung:
Die Wanderung autoaggressiver T-Zellen durch die Blut-Hirn-Schranke (BHS) ist am Ausbruch der Multiplen Sklerose (MS) und ihres Tiermodells, der Experimentellen Autoimmunen Enzephalomyelitis (EAE), entscheidend beteiligt. Unsere kürzlich gemachte Beobachtung, daß G Protein-vermittelte Signale für die Adhäsionsverstärkung enzephalitogener T-Zellen an BHS-Endothel in vivo benötigt werden, macht eine direkte Beteiligung von Chemokinen an diesem Vorgang wahrscheinlich. Um direkt an der Lymphozytenrekrutierung beteiligt zu sein, müssen Chemokine entweder von BHS-Endothelzellen exprimiert werden oder sie würden einen bisher unbekannten Transportmechanismus vom Parenchym des Zentralen Nervensystems (ZNS) durch die endotheliale BHS auf die luminale Oberfläche der Endothelzellen benötigen. Von der endothelialen BHS exprimierte Chemokine wurden mit Hilfe von in situ Hybridisierungs- und immunhistochemischen Methoden identifiziert, wodurch die Expression der lymphoiden Chemokine CCL19 und CCL21 in Venolen gezeigt wurde, die von inflammatorischen Zellen umgeben waren. Gleichzeitig wurde die Expression ihres gemeinsamen Rezeptors, CCR7, in inflammatorischen Zellen in Gehirn- und Rückenmarkgewebeschnitten an EAE erkrankter Mäuse detektiert. Enzephalitogene T-Zellen wiesen sich durch Oberflächenexpression von CCR7 und des alternativen Rezeptors für CCL21, CXCR3, aus. In vitro zeigten sie eine Konzentrations und Pertussis Toxin-abhängige, chemotaktische Reaktion, die mit der naiver Lymphozyten vergleichbar war. Die funktionelle Beteiligung von CCL19 und CCL21 an der Adhäsionsverstärkung enzephalitogener T-Lymphozyten wurde in vitro durch Bindungsversuche auf Gefrierschnitten an EAE erkrankter Mäuse und in vivo durch vorläufige Ergebnisse intravitaler Fluoreszenzvideomikroskopie im Rückenmark gesunder Mäuse gezeigt. Die teilweise Hemmung der Bindung enzephalitogener T-Lymphoblasten, die beobachtet wurde, legt die Beteiligung weiterer, möglicherweise unbekannter Chemokine an der Rekrutierung von Lymphozyten durch die BHS in das immunprivilegierte ZNS nahe. Derartige Chemokine, Rezeptoren, sowie weitere Moleküle wurden in BHS-Endothelzellen mit Hilfe von Oligonukleotid-Mikroarrays, subtraktiver-Unterdrückungshybridisierung und Proteomik Ansätzen identifiziert. Abgesehen von der verstärkten Expression von Genen und Proteinen, deren Einfluß auf die Leukozytenrekrutierung wšahrend des Krankheitsverlaufs der EAE bereits gezeigt wurde, wurden weitere Gene und Proteine identifiziert, deren Beteiligung am Krankheitsverlauf der EAE bisher nicht beschrieben war. Zu den letzteren gehörte der Duffy Antigen / Rezeptor für Chemokine (DARC), dessen Beteiligung an der Lymphozytenrekrutierung während des EAE Krankheitsverlaufs daher nahe liegt. Dies wurde mit Hilfe DARC-defizienter Mäuse bewiesen, da deren Krankheitsausbruch verzögert, aber die klinischen Symptome während der EAE verstärkt waren. Dies kann durch eine doppelte Funktion von DARC während des EAE Krankheitsverlaufs erklärt werden. Entweder transportiert auf Endothelzellen exprimiertes DARC Chemokine auf die luminale Seite der Endothelzellen (,,Pendelverkehr-Funktion") oder auf Erythrozyten exprimiertes DARC entfernt die Chemokine (,,Abfluß-Funktion"). Somit ergeben sich entweder erhöhte oder gesenkte Chemokinkonzentrationen, die für enzephalitogene T-Lymphozyten zugänglich sind. Deren Enzephalitogenität wurde mit Hilfe von Oligonukleotid-Mikroarrays und subtraktiver-Unterdrückungshybridisierung durch Vergleich enzephalitogener und nicht-enzephalitogener T-Lymphoblasten untersucht, wodurch 79 unterschiedlich exprimierte Gene identifiziert wurden. Die in dieser Dissertation erhaltenen Ergebnisse legen nahe, daß die lymphoiden Chemokine CCL19 und CCL21 maßgeblich an der Lymphozytenrekrutierung durch die BHS während des EAE Krankheitsverlaufs beteiligt sind, während der Chemokinrezeptor DARC einen Transportmechanismus für inflammatorische Chemokine vom ZNS-Parenchym durch die endotheliale BHS auf die luminale Oberfläche der Endothelzellen während des EAE Krankheitsverlaufs darstellt. Weitere Gene und Proteine, die entweder in Endothelzellen oder T-Lymphoblasten unterschiedlich exprimiert wurden, weisen auf neue Mechanismen während der Leukozytenrekrutierung über die BHS hin.


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