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Titel:Protein-Histidin-Phosphatase: Strukturelle Eigenschaften und Identifizierung der ATP-Citrat-Lyase als Substrat
Autor:Bechmann, Gunther
Weitere Beteiligte: Klumpp, Susanne (Prof. Dr.)
Erscheinungsjahr:2004
URI:http://archiv.ub.uni-marburg.de/diss/z2004/0334
URN: urn:nbn:de:hebis:04-z2004-03342
DOI: https://doi.org/10.17192/z2004.0334
DDC: Medizin, Gesundheit
Titel(trans.):Protein histidine phosphatase: structural aspects and identification of the ATP-citrate lyase as a substrate

Dokument

Schlagwörter:
Phosphatasen, histidine, signal transduction, Histidin, phosphatase, Signaltransduktion

Zusammenfassung:
Für die Protein-Histidin-Phosphatase (PHP) wurde im Rahmen dieser Arbeit die ATP-Citrat-Lyase (ACL) als erstes physiologisches Substrat identifiziert. Weil eine konventionelle Phosphorylierung mit [gamma-32P]ATP in Gegenwart von Magnesiumionen eine Vielzahl phosphorylierter Proteine ergeben hätte, wurde eine Methode verwendet, die spezifisch am Histidin phosphorylierte Proteine aufzeigte. Die Phosphorylierung des löslichen Extraktes aus dem Gewebe der Kaninchenleber mit [gamma-32P]ATP und EDTA ergab drei Proteinbanden (20, 40, 110 kDa) bei SDS-PAGE. Nach Zugabe der PHP kam es zur Dephosphorylierung der 110 kDa-Bande. Um das Substrat mit Hilfe von Sequenzanalysen zu identifizieren, wurde die 110 kDa-Bande mit drei säulenchromatographischen Schritten gereinigt. Der lösliche Extrakt aus dem Gewebe der Kaninchenleber wurde auf eine Anionenaustausch-Chromatographiesäule gegeben, es folgten eine Affinitätschromatographie und Gelfiltration. Das Substrat eluierte bei einem Molekulargewicht von ca. 450 kDa. Die Diskrepanz zwischen den 110 kDa bei der SDS-PAGE war zurückzuführen auf den denaturierenden Effekt des SDS, so dass erste Hinweise auf ein multimeres Enzym vorlagen. Die Sequenzanalysen bestätigten auch diese Vermutung: die native ACL liegt als Tetramer mit einem Molekulargewicht von 440 kDa vor; sie weist vier fast identische Untereinheiten von je 110 kDa auf. Zusätzlich wurde die ACL durch Versuche mit ADP verifiziert. Nach Phosphorylierung der Kaninchenleber oder der gereinigten ACL mit [gamma-32P]ATP und EDTA verschwand das 110 kDa-Signal bei Zugabe von ADP im Gegensatz zu GDP, AMP und ATP. Neben den proteinbiochemischen Methoden zum Auffinden eines Substrates wurden molekularbiologische Methoden in Verbindung mit dem Aufbau einer Zellkultur eingesetzt, um Einblicke in die strukturellen Aspekte der PHP zu erlangen. Über ein Baculovirus-Expressionssystem wurde das PHP-Gen in sf9-Zellen erfolgreich exprimiert und anschließend über eine Nickel-NTA-Säule gereinigt. Die rekombinante PHP war von seinen enzymatischen Aktivitäten vom nativen Enzym (gereinigt aus der Leber) nicht zu unterscheiden. Analog zu diesem Vorgang wurden Mutanten exprimiert und gereinigt. Dieses waren im Einzelnen eine Mutation des Cystein(73) sowie die komplette Änderung des Nucleotid-Bindestellenmotivs ab der Aminosäure 75 (GxGxx[G/S]) in jeweils ein Alanin. Zusätzlich wurden zehn Aminosäuren am N- und C-Terminus deletiert. Die Aktivitätstests mit der ACL als Substrat zeigten folgendes Bild: neben dem exprimierten Wildtyp war nur die Mutation mit dem ausgetauschtem Cystein aktiv, d.h. Cystein(73) ist für die Enzymaktivität nicht essentiell. Anders dagegen die Befunde von den Deletionen und von den Mutationen des G-Motivs: PHP, der die 10 N-terminalen Aminosäuren fehlen, ist nicht enzymatisch aktiv. Wird bei der PHP die nucleotidbindende Sequenz mutiert, so führt dies ebenfalls zu einem Verlust der Enzymaktivität. Es konnten somit bereits drei Bereiche der PHP identifiziert werden, die für die Dephosphorylierung der ATP-Citrat Lyase entscheidend sind. Mit dem hier erlangtem Wissen über die bedeutsamen Bereiche der Aminosäuresequenz der PHP können in der Zukunft weitere Erkenntnisse über Spezifität und Regulation gewonnen werden. Noch weiter gedacht, können über die biologischen Wirkungen der PHP pharmakologische Ansätze abgeleitet werden. Es ist durchaus realistisch, dass die PHP bald ein Zielprotein für die Arzneistoffentwicklung darstellt. Bei vielen Krankheiten wie Krebs, Diabetes und der rheumatoiden Arthritis spielen abnormale Phosphorylierungen der Proteine eine entscheidende Rolle. Mehr noch, manche Inhibitoren von bestimmten Phosphatasen sind bereits therapeutisch relevant.

Summary:
As expected, conventional phosphorylation of rabbit liver with [gamma-32P]ATP in the presence of Mg2+ resulted in hundreds of phosphorylated proteins. For the specific detection of proteins phosphorylated on histidine, a method was utilised which exclusively detects histidine phosphoproteins. Phosphorylation of rabbit liver with [gamma-32P]ATP in the presence of EDTA labeled only three proteins with molecular masses of about 20, 40 and 110 kDa under denaturing electrophoretic conditions. Addition of protein histidine phosphatase (PHP) resulted in the dephosphorylation of the 110 kDa protein. In contrast, histidine phosphoproteins of 20 and 40 kDa were not affected by PHP. Following its phosphorylation in the presence of EDTA the 110 kDa protein was purified and detected by autoradiography. The three chromatographic steps of the purification were anion exchange, affinity chromatography and gelfiltration. Gelfiltration revealed the surprising result that we were dealing with a protein of ~450 kDa. The discrepancy in its molecular mass depending on native conditions (gelfiltration: 450 kDa) versus denaturing conditions (SDS-PAGE: 110 kDa) was indicative of a multimeric enzyme. Sequence information revealed peptides of ATP-citrate lyase (ACL). The identity of ACL was further verified by taking advantage of the fact that phosphate bound to ACL can be removed by ADP but not by GDP, AMP and ATP. In summary, the ATP-citrate lyase was identified as the first physiological substrate of protein histidine phosphatase. Molecular/biological techniques were established to get information concerning the structural aspects of PHP. Recombinant baculoviruses as vectors were used to express the PHP in cultured insect cells. Afterwards the protein was purified with metal affinity resins. There were no differences between the recombinant PHP and the native enzyme due to their activities. In analogy mutants of the PHP were expressed and purificated. In the first case Cys(73) was mutated to Ala(73). Another mutation to Ala was the complete change of the nucleotide-binding region (G(75)xG(77)xxS(80)). By deleting ten amino acids at the N- as well as at the C-terminus further mutations were made. Assays with ACL as the substrate showed that not only the expressed wildtype was active but also the mutation Cys(73). Therefore, Cys(73) is not essential for the catalytic activity. The other mutations showed a loss of the enzymatic activity. The autophosphorylated ACL was not dephosphorylated. This means there could be important amino acids for the catalytic reaction at both ends of the PHP or in the region of the nucleotide-binding region. To identify these amino acids is an interesting project. With the results of these important regions of the amino acid sequence you can get further insights about the specificity and the regulation of the PHP.


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