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Titel:Einfluß verschiedener Desinfektions- und Sterilisationsverfahren für allogene Knochentransplantate auf die Osteoblastenfunktion in-vitro
Autor:Hofmann, Alexander
Weitere Beteiligte: Prof. Dr.med. Gotzen, Leo
Erscheinungsjahr:2004
URI:http://archiv.ub.uni-marburg.de/diss/z2004/0215
DOI: https://doi.org/10.17192/z2004.0215
URN: urn:nbn:de:hebis:04-z2004-02152
DDC: Medizin, Gesundheit
Titel(trans.):The influence of different disinfection and sterilization methods for allogeneic bone grafts on osteoblast function in-vitro

Dokument

Schlagwörter:
Zellkultur, Knochentransplantation, bone, Osteoblast, allograft, Allogenes Transplantat, cell culture, Osteoblast

Zusammenfassung:
In speziellen Situationen mit ausgedehntem Knochensubstanzverlusst ist die Verwendung von allogenen Knochentransplantaten unumgänglich. Das allogene Knochentransplantat muss dabei viele Anforderungen erfüllen, die vor allem seine Sterilität, die Erhaltung der osteokonduktiviven und osteoinduktiviven Eigenschaften, sowie eine adäquate Resorbierbarkeit betreffen. Aufgrund der Problematik einer potenziellen Krankheitserregerübertragung durch allogene Knochentransplantate werden heute zahlreiche Knochendesinfektions- und Sterilisationsverfahren angewendet. Die biologischen Eigenschaften unterschiedlich behandelter Knochentransplantate sind aufgrund ihrer physikalischen und chemischen Veränderung im Hinblick auf die Einheilung und das Knochenremodelling jedoch sehr unterschiedlich. Als eine mögliche Erklärung für diese Beobachtungen wird die Erhaltung bzw. die Zerstörung von bestimmten Proteinbestandteilen (z.B. BMP) der Knochenmatrix postuliert, die eine osteoinduktive Potenz aufweisen. Als Zielzellen dieser Proteine fungieren unter anderem die Osteoblasten, die ihrerseits neues Osteoid bilden, die Osteoklasten aktivieren und so das Knochentransplantatremodelling einleiten. In der vorliegenden Arbeit wurde der Einfluss von fünf etablierten Knochendesinfektions- und Sterilisationsverfahren (Autoklavierung, Ethylenoxidsterilisation, Demineralisierung und Niedrig-Temperatur-Plasmasterlisation, Chemische Sterilisation nach TutoplastÒ, Thermodesinfektion bei 80°C) auf die Osteoblastenfunktion untersucht, um die Veränderung der Zelladhäsion, der Vitalität, der Proliferation, der Differenzierung und der Proteinsyntheseaktivität nachzuweisen. Die Ergebnisse zeigen, dass die Temperaturbehandlung der Knochenmatrix eine Auswirkung auf die Adhäsion der Osteoblasten hat. Die Behandlung mit besonders hohen Temperaturen (Autoklavierung) führt dazu, dass im serumhaltigen Medium die Zelladhäsion im Vergleich zur D-NTP-Gruppe (Demineralisierung und Niedrigtemperatur-Plasmasterilisation) verlangsamt erfolgt. Die D-NTP-Gruppe zeigte von allen Gruppen insgesamt die höchsten Adhäsionsraten. Die Bedeutung der Serumproteine für den Adhäsionsprozess der Osteoblasten auf der Knochenmatrix wurde aus dem analogen Versuch ohne Serumzusatz zum Medium ersichtlich. Die Zelladhäsionsdynamik war insgesamt verlangsamt, wobei die Zellen der D-NTP-Gruppe wiederum schneller adhärent wurden. Die deutlichen Unterschiede zwischen der AUT- und anderen Testgruppen egalisierten sich vollständig, wenn das Serum im Inkubationsmedium fehlte, was für die Veränderung der Bindungskapazität der Knochenmatrix für Serumproteine durch die Erhitzung spricht. Betrachtet man die Ergebnisse einzelner Versuche insgesamt und vor allem solche Proliferationsparameter wie MTT-Aktivität und DNA-Gehalt, so lässt sich zweifelsfrei ein stimulativer Effekt der Knochenmatrix auf das Wachstum und die Differenzierung der periostalen Osleoblasten feststellen. Bei vergleichbar schneller Proliferation der Zellen der Kontrollgruppe waren die spezifischen Differenzierungsparameter (Osteokalzinsynthese) in der Kontrollgruppe im Vergleich zu anderen Testgruppen merklich verringert. Die höchsten Proliferationsraten nach 1 und 3 Wochen wurden im MTT-Versuch in der D-NTP-Gruppe festgestellt. Diese Ergebnisse korrespondieren mit dem DNA-Gehalt der Zellkulturen in der D-NTP-Gruppe, der nach der ersten Woche auf das 3,7fache und nach der dritten Woche auf das 9,4fache des Ausgangswertes und deutlich höher, als in allen anderen Gruppen, zugenommen hatte. Die höchste Konzentration der gelösten Proteinsubstanz wurde nach der ersten Woche in der CLD-Gruppe (Tutoplast-Verfahren) registriert. Während der weiteren Inkubation waren die höchsten Proteinkonzentrationen wiederum in der D-NTP-Gruppe beobachtet. Ähnlich hohe Konzentrationen wurden in den CLD- und 80°C-Gruppen erst nach einer Inkubationsdauer von 4 Wochen erreicht. Eine ähnliche Tendenz war auch aus der Gesamtproteinbestimmung des Zelllayers festzustellen, wobei die höchsten Werte in der D-NTP-Gruppe sowohl nach zwei, als auch nach vier Wochen gemessen wurden. Extrazelluläre Matrixproteine wie Kollagen Typ I sind notwendig für die Adhäsion, Migration, Proliferation und Differenzierung der Osteoblasten. Die Ergebnisse dieser Arbeit zeigen, dass verschiedene Behandlungsmethoden für Knochentransplantate die Kollagensynthese der Osteoblasten beeinflussen. Die höchsten Konzentrationen des Kollagen Typ I und III konnte in der D-NTP-Gruppe beobachtet werden. Diese Marker der ECM-Synthese korrelieren in dieser Gruppe mit den Ergebnissen der Gesamtproteinbestimmung und der Osteokalzinexpression, dem wichtigsten Marker der Osteoblastendifferenzierung. Die D-NTP-Behandlung der Knochentransplantate führt demnach nicht nur zu einer starken Induktion der Zellproliferation und Differenzierung der Osteoblasten, sondern auch zu einer deutlich verstärkten Expression der extrazellulären Matrix. Die zweithöchste Expression des Kollagen Typ I wurde in der 80°C-Gruppe festgestellt, gefolgt von den AUT-, CLD- und der EtO-Gruppen. Die vorliegende Arbeit beschreibt ein in-vitro-Modell zur Untersuchung des Einflusses verschiedener Sterilisations- und Desinfektionsverfahren für allogene Knochentransplantate auf die Funktion primärer boviner Osteoblasten. Im vorliegenden Versuch konnte zum ersten Mal ein deutlicher Einfluss unterschiedlicher Desinfektions- und Sterilisationsverfahren für Knochentransplantate auf die Osteoblastenfunktion gezeigt werden.

Summary:
One important reason for different clinical outcome after bone allografting might be the alteration of cell adherence, viability, and differentiation by different processing methods. In order to assess the influence of eight different sterilisation and disinfection methods for bone allografts on adhesion, proliferation, and differentiation of bovine periosteal osteoblasts, cells were grown in culture and then plated onto pieces of human bone allografts. We tested autoclaved bone (AUT), demineralised and low-temperature-plasma sterilised bone (D-LTP), ethylene oxide sterilised bone (EtO), 80°C-thermodisinfected bone (80°C), and chemical solvent disinfected bone (CSD). The seeding efficiency was determined during the first hour of incubation to detect the number of attached cells but before mitosis starts. The cell viability was tested after a culture period of 7 and 21 days using the MTT-assay and determination of the total DNA content. Tests to confirm the osteoblastic function and differentiation of the cells included measuring of the total protein amount, histochemical alkaline phosphatase staining and quantitative determination of AP-activity, ELISA for osteocalcin and SDS-PAGE for collagens. Results showed that heat processing of bone matrix clearly influenced the adhesion, proliferation and differentiation of osteoblasts. Further, serum protein mediated cell adhesion upon bone allograft surfaces was altered by different processing methods. Most cells adhered to D-LTP-bone. Highest proliferation rates of periosteal osteoblasts as measured via MTT-activity and total DNA-content were also found within the D-LTP-group after one and three weeks. Highest expression levels of solved and ECM-proteins were found in CLD- and D-LTP groups, followed by the 80°C-group. Extracellular matrix proteins (e.g. Collagen Type I) are necessary for the attachment, migration, proliferation, and differentiation of osteoblasts. The present study clealy shows that different processing methods directly influence the gene expression of collagens Type I and III. The highest expression levels of this ECM-marker was found in the D-LTP-Group, followed by 80°C, AUT, CLD, and EtO-groups. Corresponding to this findings, expression of specific differentiation markers of osteoblastic phenotype AP and osteocalcin were significantly increased in D-LTP group. Growth factor activity (TGF?s, BMP?s) of the allograft matrix may be responsible for these effects. The study reports an in-vitro model to examine the influence of different processing methods for allogenic bone grafts on single cell types. For the first time a direct change of osteoblast growth and funtion caused by processed bone grafts was shown in the present work.


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