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Titel: Lokalisation und Gen - Expressionsregulation der neutralen Endopeptidase in der humanen Prostata
Autor: Song, Jian
Weitere Beteiligte: Prof. Dr. G. Aumüller
Erscheinungsjahr: 2004
URI: https://archiv.ub.uni-marburg.de/diss/z2004/0167
URN: urn:nbn:de:hebis:04-z2004-01671
DOI: https://doi.org/10.17192/z2004.0167
DDC: Medizin, Gesundheit
Titel(trans.): Localization and Gene Expression Regulation of Neutral Endopeptidase in Human Prostate

Dokument

Schlagwörter:
gene expression, Neprilysin, Androgene, Neuropeptide, Prostate, in situ RT-PCR, In Situ RT-PCR, Prostata, Transkription <Genetik>, Neprilysin, NEP, Lokalisation

Zusammenfassung:
Die neutrale Endopeptidase (NEP, EC 3.4.24.11; weitere Synonyme: Neprilysin, CD 10, CALLA) ist ein Typ II - integrales Membranenzym in Säugerzellen, die als Zink enthaltende Endopeptidase die lokale Konzentrationen der Peptidsubstrate und der dazugehörigen Peptid-vermittelten Signalübertragungsprozesse steuern kann. Im Gegensatz zu den anregendaten, die von NEP-Aktivität und -Regulation in den Prostataepithelzellen handeln, nur einige Studien sind auf dem zellularen Expression und der Lokalisation der NEP in den Stromal- und Karzinom-zellen der Prostata vorhanden. Um zu prüfen, ob Unterschiede in der NEP-Verteilung in der normalen und der pathologisch veränderten Prostata als auch in der Prostatazellen bestehen, wurde die NEP-Lokalisation mit Hilfe der indirekten Immunfluoreszenz - Methode an Prostatazellen und Paraffinschnitten der humanen Prostata untersucht. In der normalen adulten Prostata, wurde die NEP hauptsächlich an der apikalen Plasmamembran detektiert. Im Stroma wurden die Endothelzellen der Kapillaren und einige glatte Muskelzellen schwach gefärbt. In hyperplastischen Drüsen war die Immunreaktivität der NEP in den adluminalen Zellen an der apikalen Plasmamembran nachzuweisen. Im Stroma wurden auch die Endothelzellen der Kapillaren und glatte Muskelzellen gefärbt. Im Prostatakarzinom war meist eine generalisierte Immunreaktivität der Zellen vorhanden und die NEP war nicht auf die apikale Plasmamembran beschränkt. Sie verteilte sich vielmehr im gesamten Zytoplasma und ist damit offensichtlich ein Indikator für den Polaritäts- bzw. Differenzierungsverlust in anaplastischen Prostata-karzinomzellen. Die LNCaP zeigten eine intensive Färbung der Plasmamembran, das gesamte Zytoplasma wurde schwächer gefärbt, während die hPCPs nach Inkubation mit dem Antikörper nur eine schwache Reaktion in Zytoplasma aufwiesen. NEP-Genexpression wurde von RT-PCR überwacht, und NEP mRNA im menschlichen Prostatagewebe und in Prostatazellen wurde mittels in-situ-RT-PCR ermittelt. Prostatagewebe zeigte starke Signale im glandulären Epithel und schwache Signale im Stroma, kultivierte Zellen zeigten starke Signale in den Prostatakrebszellen (LNCaP) und schwache Signale in den stromal Zellen an (hPCPs). Die NEP-Protein wurde mit Hilfe der Westernblot-Analyse an Lysaten der epithelialen LNCaP und der stromalen hPCPs nachgewiesen. Die Experimente bestätigen den Expression von NEP nach beiden Zelle Arten, jedoch zeigte das Experiment mit hPCPs Zellen zwei Bänder. Um zu untersuchen, ob Androgene und Neuropeptide in die Expression der NEP in LNCaP- bzw. hPCPs-Zellen involviert sind, wurde die Expression der NEP durch Northern-Blot-Analyse der Total-RNA untersucht. Ohne Stimulation ist eine grundlegende NEP-Expression in den LNCaP-Zellen detektierbar, Die Behandlung mit DHT bzw. Bombesin führt zu einer 4-Fach-Erhöhung der NEP-Expression. In den hPCPs-Zellen ist kaum eine NEP-Expression detektierbar und die Expression ist unabhängig von DHT- oder Bombesin-Stimulation. Die basale NEP-Expression in den hPCPs-Zellen besitzt im Vergleich zu den LNCaP-Zellen nur eine um ca. 30% Menge. Die Sequenzanalyse des NEP-Promotors deckt zwei Androgenresponsionselemente einschließlich ein typisches ARE auf, welches Androgen-, Progesteron- und Glukocorticoid-Receptoren bindet und ein einzigartiges ARR, das nur Androgenreceptor bindet. Durch Deletionsanalyse und Transfektionsexperiment der Promotorkonstrukte wurden mehre cis-regulatorische Elemente am NEP-Typ II Promotor identifiziert. Mit Deletionsanalyse und Transfektionsexperiment der Promotorkonstrukte, DNase I Footprinting und Bandshift wurden zwei an die proximale Promotorregion bindene Faktoren identifiziert, ein Sp-Faktor an der GC-Box von -250 bis -262 bindet und ein NF-Y Faktor an der CCAAT-Box im Schutzbereich -142 / -110 des Promotors bindet. Transfektion des Reportergenkonstruktes mit durch Mutation standene Variation der Verbindungsstelle, die in EMSAs die DNA-Bindung blockieren kann, zeigte, daß NF-Y für die basale Aktivität des Promotors wichtig ist und daß der Sp-Faktor wichtig für die Androgen-Responsewirkung des Androgen-Responseelements ist.

Summary:
Neutral endopeptidase (NEP / CD10) is a cell surface zinc metalloproteinase that functions as part of a regulatory loop controlling local concentrations of peptide substrates and associated peptide-mediated signal transduction processes. In contrast to the encouraging data dealing with NEP activity and regulation in prostate epithelial cells, only a few studies are available on the cellular expression and localization of neutral endopeptidase in the prostatic stromal and cancer cells. Immunofluorescence and western blot experiments were performed to control the expression and distribution of the NEP in normal and malignant human prostatic tissues and cell lines. NEP gene expression was monitored by RT-PCR, NEP mRNA was detected in human prostatic tissue and in cultured cells by means of in situ RT-PCR. Prostatic tissue showed strong signals in the glandular epithelium and weak signals in the stroma, cultured cells displayed strong signals in prostate cancer cells (LNCaP) and weak signals in stromal cells (hPCPs). NEP-immunofluorescence was strong in normal prostatic epithelium and confined to the apical plasma membrane. In dedifferentiated prostate cancer specimens, immunofluorescence of apical plasma membranes was lost, and both the cytoplasm and portions of the plasma membrane were immunoreactive for NEP. Prostate cancer cells (LNCaP) showed a strong immunoreaction of the plasma membrane and the cytoplasm. In comparison with LNCaP cells, only a weak cytoplasmic immunofluorescence was found in some stromal cells (hPCPs). Western blot experiments were performed using whole cells extracts to proof the presence of NEP protein in LNCaP and hPCPs. The experiments confirm the expression of NEP by both cell types, however, the experiment with hPCPs cells showed two bands. To study the regulation of NEP expression, Northern blot analysis of total RNA from LNCaP cells showed that NEP-mRNA was 4-fold increased by DHT and bombesin. Expression of NEP in hPCPs cells was very low and was not induced by DHT or bombesin. Sequence analysis reveals two androgen response elements including a typical ARE which binds androgen, progesterone and glucocorticoid receptors, and a unique ARR which only binds androgen receptor. Analysis of promoter deletions using luciferase reporter constructs showed that -379~-154 fragment of the promoter still containing the Sp-1 binding site are sufficient to confer androgen responsiveness to the reporter gene. DNase I footprinting identified two factors binding to the proximal promoter region that were found to be the ubiquitous Sp family transcription factors and CCAAT-box transcription factor NF-Y. Analyses of promoter constructs with mutations in the Sp and NF-Y binding sites demonstrated that NF-Y factor significantly contributes to the basal activity, and that Sp helps to mediate the androgen response.


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