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Titel: Biochemical characterization of the Structural Maintenance of Chromosomes (SMC) complex from Bacillus subtilis
Autor: Volkov, Arsen
Weitere Beteiligte: Graumann, Peter (PD Dr.)
Erscheinungsjahr: 2004
URI: https://archiv.ub.uni-marburg.de/diss/z2004/0142
DOI: https://doi.org/10.17192/z2004.0142
URN: urn:nbn:de:hebis:04-z2004-01428
DDC: 570 Biowissenschaften, Biologie
Titel(trans.): Biochemische Charakterisierung des Structural Maintenance of Chromosomes (SMC) Komlpex aus Bacillus subtilis

Dokument

Schlagwörter:
Bacillus, chromosome condensation, Segregation, SMC, SMC, Bacillus, Bacillus, segregation, Chomosomenkondesation

Summary:
Structural Maintenance of Chromosomes (SMC) proteins play a key role in the chromosome dynamics throughout the cell cycle in almost all species from bacteria to eukaryotes. Proteins from SMC family are involved in a number of processes, such as chromosomes condensation and segregation, sister-chromatid cohesion and DNA double strand break repair. All SMC proteins share a typical structure and consist of N- and C-terminal domains carrying the ATPase motif, the hinge domain and two central coiled-coil domains. Terminal domains come together to form one head domain, while coiled coil domains form a single coiled coil. SMC proteins form an intermolecular dimer via interaction of hinge domains. All eukaryotic SMCs perform their function in complex with a number of other none SMC subunits and recently, two novel prokaryotic proteins, ScpA and ScpB, have been found to interact with bacterial SMC in vivo. In this work, biochemical studies were performed to understand the properties of B. subtilis SMC, ScpA and ScpB in vitro, and to elucidate the mechanism of their action in vivo. The main state of ScpB in solution was found to be a dimer, while ScpA exists in both monomeric and dimeric forms. Using different approaches, such as size exclusion chromatography, gel shift assay and sucrose gradient ultracentrifugation, I found that SMC, ScpA and ScpB indeed form a ternary complex, which most likely consists of one SMC dimer, two ScpAs and two ScpB dimers. ScpA and ScpB were also able to form two types of complexes in absence of SMC: one formed by one ScpA and a dimer of ScpB, and a larger complex most likely consisting of two ScpAs and two ScpB dimers. ScpB was shown to interact with SMC indirectly only in presence of ScpA, and ScpA interacted stably with the SMC head domains only in the presence of ScpB. In addition, gel filtration assays suggested that the SMC complex is most likely formed by direct binding of the ScpA/ScpB complex to SMC, rather than through binding of individual ScpA and ScpB molecules to SMC. Sucrose gradient analysis also showed that ScpA, ScpB and SMC are present as a complex as well as in non-complexed form, indicating that the SMC complex is in a dynamic state in vivo. Another aspect investigated here were the DNA binding properties of SMC, ScpA, ScpB as well as of different domains of SMC. I found that neither ScpA, nor ScpB are required for binding of SMC to DNA, and that they have no affinity to DNA in absence of SMC. Isolated hinge and head domains of SMC were also unable to bind DNA, thus, the complete SMC molecule is needed for proper function. SMC bound to dsDNA in a sequence independent manner, and based on data obtained from surface plasmon resonance experiments, binding to DNA occurred via formation of a closed ring-like structure. The data suggest that SMC interacts with DNA via dimerization of its head domains leading to the formation of a ring-like structure with DNA trapped in between the coiled-coil (domains) arms of SMC. Collaborative AFM studies have also shown ring formation by SMC, and large complex structures formed by SMCs were detected in solution that could explain why SMCs in bacterial cells are concentrated in certain regions of the cells (foci) and are not distributed (throughout the inner cellular space) all over the chromosome. Mutagenesis studies were another part of the project. SMC proteins have a weak ATPase activity and head domains contain conserved motifs that are typical for ABC-type ATPases. In this work I have shown, that ATP binding, but not ATP hydrolysis, is required for DNA binding of SMC. Additionally, none of these activities were required for complex formation with ScpA and ScpB, although formation of the SMC complex was less efficient in the mutant proteins. A model is suggested that ATP binding induces dimerization of head domains causing formation of a ring by SMC with DNA locked in the middle. Data obtained from gel filtration studies suggest that ScpA, in absence of ScpB, causes DNA release from SMC, while in the presence of ScpB, all three proteins form a stable complex. Therefore the condensation state of chromosomes in vivo could possibly be controlled by the levels of ScpB in the cell.

Zusammenfassung:
Structural Maintenance of Chromosomes (SMC) Proteine spielen eine zentrale Rolle in mehreren Aspekten von Chromosomen Dynamiken während des Zellzyklus in fast allen Zellen, von Bakterien bis zu Eukaryonten. Proteine der SMC Familie führen essentielle Funktionen in einer Vielzahl von Prozessen aus, wie bei der Chromosomen-Kondensation und Segregation, Schwesterchromosomen Kohäsion und DNA Doppelstrandbruch Reparatur. SMC Proteine besitzen eine ungewöhnliche Struktur, bestehend aus N- und und C-terminalen Domänen, die ATPase Motive beinhalten, aus einer Scharnier hinge Domäne und zwei zentralen coiled coil Domänen. Die terminalen Domänen kommen zusammen und bilden die Kopfdomäne aus, während die coiled coil Domänen ein coiled coil bilden. SMC Proteine bilden intermolekulare Dimere aus, durch spezifische Interaktion der hinge Domänen. Alle SMC Proteine fungieren in Komplexen mit weiteren Nicht-SMC Untereinheiten, und kürzlich wurden zwei neuartige prokaryontische Proteine identifiziert, ScpA and ScpB, die mit bakteriellem SMC Protein in vivo interagieren. In dieser Arbeit wurden biochemische Studien zur Eigenschaften und Funktion von SMC, ScpA und ScpB aus B. subtilis in vitro unternommen, um deren in vivo Funktion zu beleuchten. ScpB wurde in Lösung ausschließlich als Dimer vorgefunden, wohingegen ScpA in monomerer und in dimerer Form auftrat. Mit Hilfe von Gelfiltration, Gelshift Experimenten, Sucrose Gradienten Zentrifugation und Oberflächen Plasmon Resonanz (SPR) konnte ich nachweisen, dass SMC, ScpA and ScpB einen ternären Komplex ausbilden, höchst wahrscheinlich bestehend aus einem SMC Dimer, zwei ScpA und vier ScpB Molekülen. ScpA und ScpB interagierten spezifisch mit der SMC Kopfdomäne, jedoch nur, wenn beide Proteine vorhanden waren, wobei die Interaktion von ScpB nur indirekt über ScpA mit der Kopfdomäne erfolgte. ScpA und ScpB bildeten ebenfalls mindestens zwei Komplexe in Abwesenheit von SMC, die sich anscheinend aus einem ScpA Monomer und einem ScpB Dimer, bzw. aus einem ScpA und zwei ScpB Dimeren zusammensetzten. Gelfiltrationsexperimente legten nahe, dass der SMC Komplex durch Bindung des 2ScpA/4ScpB Komplexes an ein SMC Dimer erfolgt, und nicht durch Interaktion einzelner ScpA und ScpB Moleküle. Sucrose Gradienten zeigten, dass alle drei Proteine als Komplex und als separate Moleküle vorliegen, was auf einen dynamische Interaktion in vivo schließen lässt. Des weiteren wurden die DNA Bindungseigenschaften des SMC Komplex und einzelner Domänen von SMC untersucht. SMC konnte Sequenz-unspezifisch an DNA binden, jedoch weder ScpA noch ScpB zeigten Affinität zu DNA, bzw. waren für die DNA Bindung des SMC Komplex notwendig. Die isolierte hinge oder Kopfdomäne von SMC waren ebenfalls unfähig, an DNA zu binden, was zeigt, dass das gesamte SMC Molekül zur effektiven Interaktion mit DNA notwendig ist. SPR Experimente zeigten, dass SMC als ringförmige Struktur an DNA bindet, vermutlich über Dimerisierung der Kopfdomänen, welches zum Ringschluß führt und zum Umschließen der DNA mit den langen coiled coil Armen. Kollaborative Atomic Force Microscopy Experimente konnten tatsächlich ringförmige SMC Strukturen nachweisen, sowie große, sonnenartige Strukturen in Lösung auflösen, welche eine Erklärung für die Beobachtung sein könnten, dass der SMC Komplex definierte, subzelluläre Strukturen auf dem bakteriellen Chromosom ausbildet und nicht über das gesamte Chromosom verteilt vorliegt. SMC Proteine haben eine schwache ATPase Aktivität und besitzen typische ABC Typ ATPase Motive. Mutagenese Studien erbrachten den Nachweis, dass ATP Bindung, nicht aber Hydrolyse, zur DNA Bindung von SMC notwendig ist. Keine der Mutationen war jedoch zur Komplexbildung mit ScpA und ScpB notwendig, obwohl die Mutanten nur weniger effizient einen SMC Komplex ausbilden konnten. Aus diesen Daten lässt sich folgendes Modell ableiten: ATP Bindung führt zur Dimerisierung der SMC Kopfdomänen, wodurch DNA im Ring eingeschlossen wird. Dissoziation von DNA könnte über ATP Hydrolyse erfolgen. Gelfiltrationsexperimente legen nahe, daß ScpA in Abwesenheit von ScpB zur Ablösung von DNA führt, wohingegen alle drei Proteine (d.h. in Anwesenheit von ScpB) einen stabilen Komplex bilden, der durch Bindung von DNA Schleifen zur Kondensation der DNA führen könnte. Somit könnte der Kondensations-Grad des Chromosoms in vivo durch die Menge von ScpB in der Zelle kontrolliert werden.


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