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Titel:Plasmodium falciparum: Funktionelle Analyse von Proteinen des sekretorischen Transportweges in transfizierten Zellen
Autor:Wiek, Sabine
Weitere Beteiligte: Lingelbach, Klaus (Prof. Dr.)
Erscheinungsjahr:2004
URI:http://archiv.ub.uni-marburg.de/diss/z2004/0112
URN: urn:nbn:de:hebis:04-z2004-01129
DOI: https://doi.org/10.17192/z2004.0112
DDC: Biowissenschaften, Biologie
Titel(trans.):Plasmodium falciparum: Functional analysis of proteins involved in secretory transport processes by transfection of cells

Dokument

Schlagwörter:
Transportvesikel, Brefeldin A, Sekretion, ARF1, Plasmodium falciparum, Sec7 Domäne, sec7 domain, ARF1, brefeldin A, Saccharomyces cerevisiae, transport vesicle, Homologe Rekombination, Transfektion, COP, COP, ARF-GEF, ARF-GEF

Zusammenfassung:
In erythrozytären Entwicklungsstadien von Plasmodium falciparum werden Parasitenproteine zu verschiedenen Kompartimenten innerhalb des Parasiten transportiert sowie in die Wirtszelle exportiert und stehen in direktem Zusammenhang mit der schweren klinischen Symptomatik der Malaria tropica. Der Transport der meisten Parasitenproteine wird durch die Gegenwart von Brefeldin A (BFA) inhibiert. Die Zielstruktur von BFA ist die konservierte Sec7 Domäne der Arf-Guanin-Nukleotid-Austauschfaktoren (Arf-Gef), die für die Aktivierung von Arf (ADP-Ribosylierungsfaktor) und für die Ausbildung von COP I-Transportvesikeln notwendig ist. Über double cross-over Gen-Austausch in P. falciparum konnte in dieser Arbeit gezeigt werden, dass eine Punktmutation innerhalb der Sec7 Domäne ausreichend ist, um BFA-Resistenz der Parasiten zu begründen. Es wurden Komplementations-Studien in der Hefe S. cerevisiae durchgeführt, die einen intermediären Phänotyp hervorbrachten und darauf hindeuten, dass das P. falciparum Arf-Gef möglicherweise als GDP-GTP-Austausch-Protein in ER-/Golgi-Transportprozessen funktioniert. In der Sec7 Region des PfArf-Gef existiert eine ungewöhnlich lange Einschubsequenz, deren Bedeutung in der Hefe und in silico untersucht wurde. Exportierte Parasitenproteine, die beispielsweise in die Kompartimente des Apikalkomplexes oder in den Apikoplast transportiert werden, besitzen meist N-terminale ER-Signalsequenzen, während viele der in die Wirtszelle transportierten Proteine interne hydrophobe Regionen besitzen, von denen angenommen wird, dass sie als ?ungewöhnliche? ER-Signalsequenzen fungieren könnten. Die interne hydrophobe Region von PfGbp130 (glycophorine binding protein) und verkürzte Varianten dieses Bereiches sowie die experimentell charakterisierte Signalsequenz von Exp-1 wurden in der Hefe S. cerevisiae als ER-Signalsequenzen getestet und erwiesen sich als nicht funktionell. Möglicherweise existieren ungewöhnliche oder verschiedene sekretorische Wege in P. falciparum, die in heterologen Systemen nicht rekonstituiert werden können. In dieser Arbeit wurden zwei Teilaspekte der sekretorischen Prozesse in P. falciparum untersucht. Die Identifizierung und molekulare Analyse weiterer Mediatormoleküle im Proteintransport des Parasiten sind notwendig, um ein möglichst komplettes Bild über die sekretorischen Abläufe entwerfen zu können.

Summary:
Plasmodium falciparum is an intracellular parasite of red blood cells. The parasite exports various proteins to numerous destinations inside of its plasma membrane and beyond into the host erythrocyte. These secreted proteins are directly related to the severe clinical symptoms of malaria tropica. The export of most parasite proteins is inhibited in the presence of brefeldin A (BFA). The conserved sec7 domain of Arf-Gef (ADP-ribosylation factor - guanine nucleotide exchange factor) is the main target of BFA. Arf-Gef proteins are necessary to activate Arf and consequently for the formation of COP I coated transport vesicles. Here it is shown by double cross-over gene replacement experiments with P. falciparum that a point mutation within the sec7 domain is sufficient to confer BFA-resistance to parasites. Complementation studies with the yeast S. cerevisiae in which the gea1 sec7 domain was replaced by the P. falciparum sec7 domain including the mutation revealed an intermediate growth phenotype. This provides evidence that P. falciparum Arf-Gef functions as a GDT-GTP-exchange protein in ER-/Golgi transport processes. The sec7 region of the arf gef gene encodes an unusual long insertion sequence. In silico modelling algorithms as well as heterologous expression in yeast cells were used here to examine the significance of this insertion sequence. Parasite proteins that are transported into intra-parasitic compartments like the apical complex or the apicoplast in many cases contain amino-terminal ER signal sequences. Many proteins destined for the host cell compartment contain internal hydrophobic regions which are putative ER-signals. The internal hydrophobic region of Gbp130 (glycophorine binding protein) and truncated versions thereof were functionally analysed as to their ER-signal potential in S. cerevisiae. The P. falciparum Exp-1 signal sequence was used as a positive control. None of the plasmodial sequences could restore ER-translocation in vivo possibly due to parasite specific transport/ translocation processes that could not be reconstituted in yeast cells. Two aspects of secretory processes in P. falciparum were investigated in this thesis. For an understanding of protein export pathways and mechanisms it is necessary to identify and characterize more mediator molecules involved in parasite secretion.


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