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Titel:Untersuchungen zur Rolle der Phosphoenolpyruvat-Carboxykinase und des NADP+-Malat-Enzyms in der filamentösen Phaeophycee Ectocarpus siliculosus
Autor:Busch, Sylvia
Weitere Beteiligte: Galland, Paul (Prof. Dr.)
Erscheinungsjahr:2004
URI:http://archiv.ub.uni-marburg.de/diss/z2004/0087
DOI: https://doi.org/10.17192/z2004.0087
URN: urn:nbn:de:hebis:04-z2004-00877
DDC: Biowissenschaften, Biologie
Titel(trans.):Investigations about the role of phosphoenolpyruvate carboxykinase and NADP+-malic enzyme in the filamentous phaeophyceaen alga Ectocarpus siliculosus

Dokument

Schlagwörter:
PEPCK, Ectocarpus, malic-enzyme, Pyrenoid, pyrenoid, carbon-acquisition, Malat-Enzym, Kohlenstoff-Akquisition, PEPCK, Ectocarpus

Zusammenfassung:
In der filamentösen Braunalge Ectocarpus siliculosus liegen die Enzyme Phosphoenolpyruvat-Carboxykinase (PEPCK) und das NADP+-Malat-Enzym in hohen Aktivitäten vor. Die Beteiligung beider Enzyme an einem für die Alge vorgeschlagenen C4/CAM-Metabolismus wurde fraglich, nachdem zum einen nicht alle der für einen vollständigen Zyklus benötigten Enzyme nachgewiesen werden konnten und zum anderen mögliche Metabolite in vivo in zu geringen Konzentrationen vorlagen, um für den postulierten Speichermetaboliten von CO2 in Frage zu kommen. Daraus ergab sich die Frage nach der zellulären Funktion der Enzyme. Zur Klärung der Funktion sowohl der PEPCK als auch des NADP+-Malat-Enzyms wurden die Enzyme aus E. siliculosus isoliert und gereinigt. Dabei wurde für die native PEPCK eine relative molekulare Masse von 90 kDa ermittelt. Nach Denaturierung in der SDS-PAGE zeigte sich ein 62 kDa- sowie ein prominenteres 18 kDa-Polypeptid. Die relative molekulare Masse des nativen NADP+-Malat-Enzyms wurde mit 440 kDa bestimmt. In der SDS-PAGE zeigte sich ein einzelnes 56 kDa-Polypeptid, und es wurde geschlossen, dass das funktionelle Enzym als Oktamer vorliegt. Für alle der für die Carboxylierungsreaktion der PEPCK benötigten Substrate ergaben sich normale Michaelis-Menten-Kinetiken mit den Km-Werten 1,46 mM (CO2), 0,5 mM (PEP) und 0,23 mM (ADP). Auch für die Decarboxylierungsreaktion des Malat-Enzyms zeigte sich mit Malat eine normale Michaelis-Menten-Kinetik (Km = 0,36 mM). Im Fall des NADP+ wurde das Vorliegen positiver Kooperativität mit einem Hill-Koeffizienten von 2,74 nachgewiesen. Dies deutet darauf hin, daß das Enzym über mindestens drei Bindungsstellen für NADP+ verfügt. Zur Herstellung spezifischer Antikörper gegen beide Enzyme wurden Kaninchen mit den denaturierten Polypeptiden nach der SDS-PAGE immunisiert. Trotz wiederholtem Ansatz und verlängertem Standardimmunisierungsprogramm ergab sich ein geeignetes Antiserum nur für das 18 kDa-Polypeptid der PEPCK. Die IgG-Fraktion dieses Serums reagierte sowohl mit dem 18 kDa- als auch mit dem 62 kDa-Polypeptid der PEPCK, was darauf hindeutet, dass beide Polypeptide Degradationsprodukte eines wahrscheinlich monomeren nativen Polypeptids sind. In Immunlokalisationsstudien mit diesem Antikörper wurde die PEPCK in den Pyrenoiden von E. siliculosus nachgewiesen. Ebenso befindet sich die Rubisco, nachgewiesen mit einem Antikörper gegen das native Enzym aus Spinat, in den Pyrenoiden. Die Lokalisation der PEPCK in direkter Nachbarschaft zur Rubisco schließt erneut die Funktion eines C4-Mechanismus bei E. siliculosus aus. Eine anaplerotische Rolle der PEPCK in den Zellen der Alge ist wahrscheinlich.

Summary:
The filamentous brown-alga Ectocarpus siliculosus shows high activities of phosphoenolpyruvate carboxykinase (PEPCK) and NADP+-malic enzyme. The putative participation of both enzymes in a C4-like carbon cycle became questionable because not all enzymes necessary for this cycle could be detected and because the relevant metabolite pools in vivo were too small. This raised the question of their cellular function. In order to clarify their function, PEPCK and the NADP+-malic enzyme were purified to homogeneity. The molecular mass of native PEPCK was determined to be 90 kDa. SDS-PAGE revealed two polypeptides of 62 kDa and 18 kDa, respectively. The molecular mass of native malic enzyme was 440 kDa. SDS-PAGE revealed only one polypeptide of 56 kDa which suggested that the native molecule might be a homo-octamer. The carboxylating-reaction of PEPCK displayed typical Michaelis-Menten-Kinetics for each substrate. The Km was 1,46 mM for CO2, 0,5 mM for PEP and 0,23 mM for ADP. The double-reciprocal plot of the activity of NADP+-malic enzyme as a function of the concentration of L-malate yielded a straight line with a Km for L-malate of 0,35 mM. With respect to the binding of NADP+ malic enzyme revealed positive cooperativity with a Hill coefficient of 2,74. This indicates at least three binding sites for NADP+. Rabbits were immunised using the denatured polypeptides after SDS-PAGE. Specific antibodies were obtained only against the 18 kDa polypeptide of PEPCK. In immunoblots, the antibodies reacted with both, the 18 kDa and the 62 kDa polypeptide of the PEPCK, indicating that they were both degradation products from a single probably monomeric polypeptide (the native 90 kDa protein). In immuno-localisation studies this antibody against PEPCK stained the pyrenoids of E. siliculosus. With antibodies against native Rubisco from spinach, Rubisco was also found to be exclusively localised in the pyrenoids. The localisation of PEPCK in direct neighbourhood to Rubisco is so far the strongest argument against the existence of a C4 pathway in E. siliculosus. An anaplerotic role of PEPCK in the alga is likely.


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