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Titel:Die Rolle des Signalpeptids für die Reifung des Lassavirus Glykoproteins
Autor:Eichler, Robert
Weitere Beteiligte: Buckel, Wolfgang (Prof. Dr.)
Erscheinungsjahr:2004
URI:http://archiv.ub.uni-marburg.de/diss/z2004/0084
URN: urn:nbn:de:hebis:04-z2004-00842
DOI: https://doi.org/10.17192/z2004.0084
DDC: Biowissenschaften, Biologie
Titel(trans.):The role of the signal peptide for maturation of the Lassa virus glycoprotein

Dokument

Schlagwörter:
Topologie, Glykoprotein, Signalpeptid, Virus, Lassa, glycoprotein, peptide, virus, Lassa, signal

Zusammenfassung:
Das Oberflächenglykoprotein des Lassavirus ist ein Typ 1-Membranprotein. Es wird als Vorläufer präGP-C synthetisiert und posttranslational mit N-Glykanen modifiziert. Nach der proteolytischen Abspaltung des Signalpeptids wird GP-C in seine beiden Untereinheiten GP1 und GP2 durch die Wirtszellprotease SKI-1/S1P prozessiert. Das Glykoproteins weist nach Analyse mit einem Computerprogramm ein SP von außergewöhnlicher Länge auf. Thema dieser Arbeit war die Charakterisierung dieses SP. 1. In der vorliegenden Arbeit wurde zunächst die exakte Länge des Signalpeptids von 58 Aminosäureresten durch N-terminale Sequenzierung der GP1-Untereinheit und Mutationsanalysen der potentiellen Signalpeptidspaltstelle ermittelt. 2. Topologische Untersuchungen ergaben, dass das Signalpeptid des Lassavirus Glykoproteins eine außergewöhnliche Struktur mit zwei hydrophoben Regionen besitzt. Daraus ergeben sich mehrere Möglichkeiten für die Topologie des Signalpeptids in der ER-Membran. In dieser Arbeit wurde gezeigt, dass nur die N-terminale der beiden hydrophoben Domänen die ER-Membran durchspannt und damit ein außergewöhnlich langer Abschnitt, der auch die zweite hydrophobe Region umschließt, im ER-Lumen vorliegt. 3. Das Signalpeptid wurde auf zusätzliche Funktionen neben der Translokationsfunktion untersucht. Hierfür wurde das native Signalpeptid durch andere Signalpeptide ausgetauscht. Dieser Austausch verhindert die Reifespaltung des Glykoproteins GP-C in seine beiden Untereinheiten GP1 und GP2. Die Spaltung wird durch Koexpression des solitären ursprünglichen Signalpeptids wiederhergestellt. Mithilfe von Mutationsanalysen wurde der Bereich des Signalpeptids, der für die proteolytische Aktivierung des Glykoproteins essentiell ist, auf den ER-luminalen Anteil des Signalpeptids eingeschränkt. Weiterhin wurde gezeigt, dass besonders der Bereich zwischen beiden hydrophoben Regionen für die Reifung des Glykoproteins notwendig ist. Über Kopräzipitationsstudien wurde eine direkte Interaktion zwischen Signalpeptid und Glykoprotein bestätigt. Diese wird über eine Wechselwirkung des Signalpeptids mit der GP2-Untereinheit des Glykoproteins vermittelt. 4. In dieser Arbeit wurde gezeigt, dass das Signalpeptid ein fester Bestandteil des Virions ist. Es konnte zudem gezeigt werden, dass die Inkorporation des Signalpeptids von der Inkorporation des Glykoproteins abhängig ist und das Signalpeptid selbst keine 5. Die Signalpeptide der Glykoproteine der Arenaviren sind homolog, eine Austauschbarkeit der Signalpeptide zwischen den Glykoproteinen der Arenaviren wurde in der vorliegenden Arbeit bestätigt. Die vorgestellten Daten sind daher auf die Signalpeptide der Glykoproteine aller Arenaviren übertragbar.

Summary:
The surface glycoprotein of Lassa virus is a type-1 membrane protein. It is synthesized as precursor preGP-C and posttranslationally modified with N-glycans. After proteolytic cleavage of the signal peptide GP-C is processed into its subunits GP1 and GP2 by the host cell protease SKI-1/S1P. After computer analysis the signal protein of the glycoprotein exhibits an unusual lenght. The topic of this work was the characterization of this signal peptide. 1. First, the exact length of the signal peptide of 58 amino acid residues was determined experimentally by N-terminal sequencing of the GP1-subunit and mutational analysis of the potential signal peptide cleavage site. 2. Topological studies have shown that the signal peptide comprises an unusual structure with two distinct hydrophobic domains. As a result, several models of the topology of the signal peptide in the ER-membrane are possible. It was shown in this work that only the N-terminal of both hydrophobic domains spans the ER-membrane leaving an extraordinary long tail, including the second hydrophobic region, ER-luminal. 3. The signal peptide was studied concerning additonal functions apart from its translocation function. To do so, the native signal peptide was replaced by other signal peptides. This replacement abolished the maturation cleavage of the glycoprotein GP-C into its subunits GP1 and GP2. Cleavage was restored upon coexpression of the solitary native signal peptide. Using mutational analysis the region of the signal peptide which is essential for proteolytic activation of the glycoprotein was mapped to the ER-luminal part of the signal peptide. Furthermore, especially the region between both hydrophobic domains is essential for maturation of the glycoprotein. Using coprecipitation experiments a direct interaction between the glycoprotein and its signal peptide was shown. This interaction is mediated by the GP2 subunit of the glycoprotein. 4. It was shown in this work that the signal peptide is a structural component of the Lassa virion. Furthermore, the incorporation of the signal peptide depends on incorporation of the glycoprotein. The signal peptide itself is not transport competent. 5. The signal peptides of the arenaviral glycoproteins are homologous, the interchangeability of the signal peptides between arenaviral glycoproteins was confirmed in this work. The presented data therefore can be transferred to the signal peptides of other arenaviral glycoproteins.


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