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Titel: Klonierung von Cytochrom P450-abhängigen Monooxygenasen aus Ammi majus L. und funktionelle Expression der Zimtsäure 4-Hydroxylase
Autor: Specker, Silvia
Weitere Beteiligte: Matern, Ulrich (Prof. Dr.)
Erscheinungsjahr: 2004
URI: https://archiv.ub.uni-marburg.de/diss/z2004/0072
DOI: https://doi.org/10.17192/z2004.0072
URN: urn:nbn:de:hebis:04-z2004-00721
DDC: Medizin, Gesundheit
Titel(trans.): Cloning of cytochrome P450-dependent monooxygenases from Ammi majus L.and functional expression of cinnamate-4-hydroxylase

Dokument

Schlagwörter:
coumarines, Abwehrreaktion, Cinnamate-4-hydroxylase, P, Ammi majus, Biosynthese, cytochrome P450, Apiaceae, PUVA, Psoralen, Xanthotoxin, CYP73A41, furocoumarines, Sellerie, Furocumarine, Zimtsäurehydroxylase, Ammi majus, Cytochrom P-450, Zimtsäure 4-Hydroxylase, Elicitor

Zusammenfassung:
Pflanzen reagieren auf Pathogenbefall mit einem komplexen System von physiologischen Reaktionen. Auslöser ist die Erkennung von Oberflächenstrukturen der Pathogene, die als Elicitoren wirken. Am Ende der Elicitor-induzierten Signaltransduktionskette steht die Aktivierung von Abwehrgenen. Ein Teilaspekt ist dabei die Akkumulation von Phytoalexinen, im Falle der Apaiceae sind es Furanocunmarine. Aus Einbaustudien und in vitro-Messungen ist bekannt, dass an der Biosynthese der Furanocumarine mehrere Cyt P450 beteiligt sind, die durch Hefe oder pilzlichen Elicitor induziert werden können. Aus cDNA von Elicitor-induzierten Ammi majus-Zellkulturen wurden fünf Cyt P450 kloniert, deren Northern-Analyse ergab, dass drei davon auf transkriptioneller Ebene induzierbar sind, wobei AmCYP71AJ1 am deutlichsten induziert wird. Sequenz 1, CYP73A41, wurde funktionell als Zimtsäure 4-Hydroxylase identifiziert und biochemisch charakterisiert. Ihre Eigenschaften entsprechen im Wesentlichen den bereits klonierten C4Hs. Es bleibt die Identifizierung der anderen Cyt P450 durch Verbesserung und Kontrolle der Expression und Suche nach möglichen Substraten. Auf dem Wege zu einer Verbesserung der Expression wurde die NADPH-Cytochrom P450 Reduktase (CPR) kloniert mit dem Ziel eine simultane Expression der CPR und des zu untersuchenden Cyt P450 in Hefe durchzuführen. Im Sequenzvergleich weist Sequenz 2 (AmCYP71AJ1) auf der Ebene der Aminosäuren 66 % Ähnlichkeit zur Menthofuransynthase (MFS) aus Mentha x piperita (Q947B7, Bertea et al, 2001) auf. Da kein Menthofuran in Ammi majus beschrieben worden, ist es unwahrscheinlich, dass AmCYP71AJ1 die Bildung von Menthofuran katalysiert. Die Induktionsstärke und der Induktionsverlauf der relativen Transkriptmenge von AmCYP71AJ1 passen zu der Induktion der Marmesinsynthase-Aktivität, einem Cyt P450 der Psoralenbiosynthese. Vermutlich handelt es sich bei AmCYP71AJ1 um ein Enzym der unspezifischen Abwehr, eventuell sogar aus der Furanocumarinbiosynthese. Die Sequenz 3 (AmCYP98A21) ist auf Aminosäureebene zu 83 % identisch mit der Ocimum basilicum p-Cumaroyl Shikimat 3'-Hydroxylase und ist auf Transkriptiosnebene induzierbar. Die Sequenz 4 (AmCYP76B8) hatte 55 % identische Aminosäuren mit der Geraniol 10-Hydroxylase aus Catharanthus roseus. Der Northern-Blot zeigte im Gegensatz zur G10H aus Catharanthus roseus keine Induktion. Eine Zuordnung der nicht induzierten Sequenz 5 (AmCYP82H1) kann nicht erfolgen. Neben der wissenschaftlichen Grundlage haben die Untersuchungen auch praktische Bedeutung. Kenntnisse über die Biosynthese der Furanocumarine sind für den Menschen von Interesse. Es hat sich gezeigt, dass der Gehalt an Furanocumarinen in Sellerie aufgrund von saurem Nebel in kalifornischen Ballungsgebieten stark zunimmt, so dass die Konzentration über der Menge liegt, die beim Menschen nach Verzehr eine Dermatitis auslösen kann. Zudem wird eine solche Pflanze ungeniessbar für Insekten. Indem man regulierend in die Biosynthese eingreift, könnte man Sellerie herstellen, der keine Psoralene enthält, und somit auch in Gebieten mit grosser Luftverschmutzung angebaut werden kann.

Summary:
Pathogenes excites a complexe system of biological reactions in plants. These are caused by certain structures on the pathogene surface, so called elicitors. The result of the elicitor-inudced signal cascade is the activation of defense genes. One effect is the accumulation of phytoalexines, in case of the Apiaceae, furanocoumarines. Former studies have shown, that several Pmg-inducible cytochrome P-450 are involved in furanocoumarine biosynthesis. Five Cyt P450 were cloned from Pmg-induced Ammi majus cell cultures, three of them inucible at transciption level, which was shown by Northern blotting. Among these clones AmCYP71AJ1 was most inducible. Sequence 1, CYP73A41, was functionally identified and biochemically characterised as cinnamate-4-hydroxylase. All parameters correlate to known cinnamate-4-hydroxylases. In the future the function of the other Cyt P450 needs to be determined by identifying possible substrates and by improving and controlling expression. Therefore, the NADPH-cytochrome P450 reductase from Ammi majus was cloned with the purpose of coexpression with the investigated Cyt P450 in yeast. Sequence 2 (AmCYP71AJ1) has shown 66 % similarity with menthofuransynthase from Mentha x piperita (Q947B7, Bertea et al., 2001) in sequence alignments; however, menthofuran has not been described in Ammi majus, so probably AmCYP71AJ1 does not catalyze this reaction. The course of induction at transcription level corresponds to marmesinsynthase activity, an enzyme of the furanocoumarine pathway. Therefore, participation of AmCYP71AJ1 in unspecific plant defense mechanisms is likely. It may even belong to the furanocoumarine biosynthesis. Up to 83 % of the amino acids of the third sequence (AmCYP98A21) are identical with Ocimum basilicum p-camaroyl shikimate 3`-hydroxylase. AmCYP98A21 is also inducible at transcription level. Sequence 4 (AmCYP76B8) shares 55 % identity with geraniol-10-hydroxylase (G10H) from Catharanthus roseus. In contrast to G10H Northern analysis showed no induction. A classification of the fifth sequence (AmCYP82H1) was not possible. The results of this investigation are not only of scientific interest, but have also practical value. Knowledge of the furanocoumarine biosynthesis is of general interest, for it has been shown, that the amount of furanocoumarines in cellery strongly increases because of acid fog in congested areas in California. The amount of furanocoumarines may then by high enough to cause dermatitis if consumed by humans, and is toxic for insects as well. The biosynthesis of furanocoumarines could be regulated to produce psoralen-free cellery, which could therefore be cultivated despite air pollution.


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