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Titel: Oxidation von atmosphärischem Methan in Böden: Ein neuer quantitativer Ansatz zur Erfassung der Struktur und Aktivität methanotropher Gilden
Autor: Kolb, Steffen
Weitere Beteiligte: Conrad, Ralf Prof. Dr. rer. nat.
Erscheinungsjahr: 2004
URI: https://archiv.ub.uni-marburg.de/diss/z2004/0070
DOI: https://doi.org/10.17192/z2004.0070
URN: urn:nbn:de:hebis:04-z2004-00704
DDC: 570 Biowissenschaften, Biologie
Titel(trans.): Oxidation of Atmospheric Methane in Soils: A Novel Quantitative Approach to Assess the Structure and Activity of Methanotrophic Guilds

Dokument

Schlagwörter:
molecular ecology, molekulare Ökologie, Methanoxidierende Bakterien, Polymerase-Kettenreaktion, Mikrobiologie, phylogenetic markergene, Methylotropher Mikroorganismus, phylogenetisches Markergen, Real-time PCR, Real-time PCR, Bodenbiologie, Biozönose, Methan

Zusammenfassung:
Atmosphärisches Methan ist nach Kohlendioxid das zweit wichtigste Treibhausgas. Aufgrund anthropogener Eingriffe steigt die Methankonzentration derzeit jährlich um 1 %. Wichtigste Quelle ist die Emission von Methan aus Feuchtgebieten (z.B. Mooren und gefluteten Reisfeldern). Neben dem Abbau in der Atmosphäre ist der Verlust des Methan in den Weltraum und die Methanaufnahme durch oxischen Böden (?Upland Soils?) die wichtigste Senke. In diesen Böden sind methanotrophe Bakterien aktiv. Ziel dieser Arbeit war es, die Zusammensetzung der methanotrophen Gilden in ?Upland Soils? quantitativ zu erfassen und die Aktivität der relevanten methanotrophen Taxa zu bestimmen. Weil bisher keine in ?Upland Soils? anwendbare, kultivierungs-unabhängige Methode zur Quantifizierung methanotropher Bakterien existierte, wurde in dieser Arbeit eine neue molekulare Methodik zur Quantifizierung entwickelt. Für methanotrophe Bakterien indikative Markergene wurden mit Real-time PCR quantifiziert. Als funktionelle Marker wurden Gene ausgewählt, die für Untereinheiten der Methan-Monooxygenasen kodieren (pmoA und mmoX) und die Phylogenie methanotropher Bakterien reflektieren. Anhand eines Vergleichs von Phylogrammen basierend auf diesen funktionellen Markergenen und Sequenzen des 16S rRNA-Gens wurden Gruppen methanotropher Gattungen abgeleitet (Hauptgruppen). Für diese Hauptgruppen wurden pmoA- oder mmoX-spezifische Real-time PCR Assays zur Quantifizierung dieser Gene entwickelt. SybrGreen diente dabei zur Detektion des gebildeten PCR-Produktes. Die Etablierung von 4-Schritt-Temperaturprofilen mit einem zusätzlichen Schritt zur Datenaufnahme ermöglichte Messgrenzen (³ 10 Zielmoleküle pro Reaktion), die vergleichbar mit Sonden-basierten Detektionssystemen wie z.B. TaqMan- oder Hybridisierungssonden waren. Auf diese Weise wurde eine quantitative Detektion von methanotrophen Bakterien anhand von Schlüsselenzymen möglich. Die Anwendung dieser Methodik an DNA-Extrakten aus Bodenproben ergab, dass mit Real-time PCR reproduzierbare Abundanzen methanotropher Hauptgruppen bestimmt werden konnten, die mit denen durch Kultivierungsmethoden bestimmte Abundanzen vergleichbar waren. Nach der Evaluierung dieser Methodik wurden zwei Waldböden in Deutschland untersucht, die Methan aus der Atmosphäre aufnahmen. MF war ein sandiger Boden mit saurem pH-Wert (4,3) auf Buntsandstein und GF ein toniger Boden mit neutralem pH-Wert (7,7) auf Muschelkalk. Grundsätzlich erwiesen sich beide Böden als aktiv hinsichtlich der Aufnahme von Methan (MF: 95[±32] mg CH4 m-2 d-1; GF: 50[±7] mg CH4 m-2 d-1). Übereinstimmend mit Befunden anderer Autoren wurden in beiden Böden die methanotrophe Hauptgruppen USC a (6,4[±0,2]x106 Zielmoleküle g-1 Boden [TG]) und USC g (11,6[±3,3]x106 Zielmoleküle g-1 Boden [TG]) nachgewiesen, die einen Anteil von mindestens 85 % an der jeweiligen methanotrophen Lebensgemeinschaft hatten und pmoA-Sequenzen von nicht-kultivierten methanotrophen Bakterien darstellten. Die zellspezifische Aktivität der Hauptgruppe USC a (17,1 x10-5 fmol Zelle-1 h-1) in Boden MF war trotz niedrigerer Gesamtabbundanz höher als die der Hauptgruppe USC g in GF (2,77x10-5 fmol Zelle-1 h-1). Dieser Aktivitätsunterschied spiegelte sich in der Tatsache wieder, dass nur mRNA des pmoA-Gens von USC a in Bodenproben gefunden wurde. Zusammenfassend lassen diese Ergebnisse den Schluss zu, dass die detektierten Taxa an atmosphärische Methan-Konzentrationen angepasste ?hochaffine methanotrophe Bakterien? waren.

Summary:
Methane (CH4) is the most important greenhouse gas after CO2. Its atmospheric mixing ratio is increasing by 1 % y-1 due to anthropogenic impact. The main sources of CH4 are wetlands (e.g. peat bogs or rice paddies) where methanogenesis takes place. Stratospheric destruction of CH4 by hydroxyl radicals, stratospheric loss into space, and CH4 uptake by upland soils are main sinks for atmospheric methane. In upland soils methane-oxidizing bacteria (MOB) are responsible for this acitivity. The aim of this work was to assess quantitatively the composition of this functional group of bacteria, and the acitivity of predominant taxa. Due to the lack of an applicable culture-independent method for quantitation of methanotrophic bacteria in soils, a novel molecular method was developed. Functional marker genes (pmoA and mmoX) that reflect the phenotype and phylogeny of methanotrophs were chosen as targets for quantitation by real-time PCR. These genes encode subunits of methane monooyxgenases. A comparison of 16S rRNA-based phylogenies to phylogenies based on these functional marker genes revealed distinct groups of methanotrophic genera (main groups). Real-time PCR assays based on pmoA and mmoX detection were developed to target these main groups. Amplicon detection was achieved by using SybrGreen. The introduction of an additional temperature step after elongation (4-step protocol) used for data acquisition led to detection limits comparable to probe-based assays (e.g. TaqMan or hybridization probes). Thus, a quantitative detection of methanotrophs by targeting the genes encoding key enzymes was possible. The cell number estimates obtained by application of this technique to soil were reproducable and comparable to estimates obtained by cultivation-dependent methods in other studies. Two upland forest soils in Germany that oxidized atmospheric methane were investigated. MF was an acidic (pH 4.3) sandy soil developed from sandstone, and GF was a neutral (pH 7.7) clay-textured soil developed from limestone. Both soils displayed high rates of atmospheric methane uptake (MF: 95[±32] mg CH4 m-2 d-1; GF: 50[±7] mg CH4 m-2 d-1). The dominant methanotrophic guilds were represented by two pmoA sequence groups from as-yet uncultivated methanotrophs. USC a (6,4[±0,2]x106 target molecules g-1 soil [dw], soil MF) and USC g (11,6[±3,3]x106 target molecules g-1 soil [dw], soil GF) contributed at least 85 % to the total detectable abundance of methanotrophic bacteria. Cell-specific activity of the taxon USC a in MF (17,1x10-5 fmol cell-1 h-1) was higher than the cell-specific activity of USC g in GF (2,77x10-5 fmol cell-1 h-1) despite the fact that the abundances of USC g were higher. Supporting this difference in metabolic activity, only mRNA of USC a (pmoA-Genes) was detectable above detection limit in soil MF, while no mRNA was detectable in soil GF. In total, these findings led to the hypothesis that these two main pmoA groups represent ?high affinity methanotrophs? adapted to atmospheric methane concentration.


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