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Titel:Rationales Enzymdesign zur Optimierung dimodularer Peptidsynthetasen
Autor:Dürfahrt, Thomas
Weitere Beteiligte: Marahiel, Mohamed A. (Prof. Dr.)
Erscheinungsjahr:2004
URI:http://archiv.ub.uni-marburg.de/diss/z2004/0067
URN: urn:nbn:de:hebis:04-z2004-00675
DOI: https://doi.org/10.17192/z2004.0067
DDC:540 Chemie
Titel(trans.):Optimization of Dimodular Peptid Synthetases by Rational Enzyme Design

Dokument

Schlagwörter:
Proteindesign, Peptidantibiotikum, Biochemische Analyse, aspartame, biochemical analysis, recombinant protein, peptide antibiotic, Rekombinantes Protein, protein design, Aspartam

Zusammenfassung:
Die modular aufgebauten, multifunktionalen nichtribosomalen Peptid-synthetasen (NRPS) katalysieren in vielen Mikroorganismen die Produktion strukturell vielfältiger, pharmakologisch interessanter Naturstoffe. Für die Integration eines Bausteins in das wachsende Produkt ist jeweils ein Modul verantwortlich, welches seinerseits in einzelne Domänen unterteilt werden kann. Diese Domänen katalysieren die Erkennung, Aktivierung und den Einbau der Substrate. Aufgrund ihrer modularen Organisation stellen die NRPS ein geeignetes System für die gezielte Entwicklung artifizieller Enzyme dar. In dieser Arbeit wurden verschiedene Strategien der Domänen- und Modulfusion verfolgt, um dimodulare Synthetasen für die Produktion des Dipeptids alpha-Aspartyl-Phenylalanin (Asp-Phe), das als Vorläufer in der Produktion des Zuckerersatzstoffs Aspartam eingesetzt wird, zu entwickeln. Ein Vergleich von sechs Asp-Phe-Synthetasen verdeutlicht die Auswirkungen von künstlichen Fusionen auf die Aktivität der Enzyme. So konnten deutliche Unterschiede in der Umsatzrate sowie die von der Umsatzrate abhängige Synthese des Nebenprodukts beta-Asp-Phe beobachtet werden. Durch den Vergleich verschiedener Fusionsstrategien am Beispiel der Asp-Phe-Synthetasen konnte das Wissen über das Design hybrider Peptidsynthetasen erweitert werden. Die strukturelle Vielfalt nichtribosomal synthetisierter Peptide wird nicht zuletzt durch die Katalyse von modifizierenden Domänen gewährleistet. Eine spezielle Domäne ist die Heterozyklisierungs-(Cy)-Domäne. Sie katalysiert neben der Bildung einer Peptidbindung die Zyklisierung der Seitenkette von Cystein, Serin oder Threonin zu Thiazolin- bzw. Oxazolin-Ringen. In dieser Arbeit wurde, basierend auf den ersten beiden Modulen der Bacitracin-Synthetase A, ein Modellsystem zur Untersuchung der Cy-Domäne entwickelt, welches das heterozyklische Isoleucinyl-Thiazolinylcystein bildet. Ausgehend von diesem Modellsystem konnten durch Modulfusionen dimodulare Hybridsynthetasen konstruiert werden, deren Fähigkeiten, neue heterozyklische Produkte zu bilden, das biokombinatorische Potential der Cy-Domäne verdeutlichen. Zusätzlich konnte durch Mutation von konservierten Resten innerhalb der Cy-Domäne des Modellsystems die Reaktionsabfolge von Peptidbindungsbildung und Zyklisierung aufgeklärt werden. Anhand der erhaltenen, mutierten Synthetasen, die nur noch die Bildung der Peptidbindung aber nicht die nachfolgende Zyklisierung katalysieren, konnte der Beweis für die Unabhängigkeit von Kondensations- und Heterozyklisierungsreaktion innerhalb der Cy-Domäne erbracht werden.

Summary:
Many microorganisms use multimodular nonribosomal peptide synthetases (NRPS) for the production of structurally diverse and pharmacological interesting compounds. Each module within these multifunctional NRPSs represents a functional unit of catalytic domains, which is responsible for recognition, activation and incorporation of the substrate into the growing peptide product. Due to the modular arrangement NRPSs are especially suitable for the construction of artificial enzymes. In this work different strategies of domain and module fusions were used to develop dimodular synthetases for the production of the dipeptide alpha-aspartyl-phenylalanine (Asp-Phe), which is used as a precursor in the production of the high intensity sweetener aspartame. Comparison of six Asp-Phe-Synthetases exposed the influence of artificial fusions on the activity of the hybrid enzymes. Varying turnover rates as well as turnover-dependent formation of the by-product beta-Asp-Phe were observed. The knowledge to design hybrid peptide synthetases is enlarged by this comparison of different fusion strategies. Structural diversity of nonribosomally synthesized peptides is mainly insured by catalysis of modifying domains. The remarkable heterocyclization-(Cy)-domain catalyzes the peptide bond-formation associated with the cyclization of the side chains of cysteine, serine or threonine. This reaction results in the formation of thiazoline and oxazoline rings respectively. Based on the first two modules of the bacitracin synthetase A, a model system was constructed that produces the heterocyclic isoleucinylcystein. Starting from this model system dimodular hybrid synthetases were assembled, which were able to form new heterocyclic products. The activities of these constructs demonstrate the biocombinatorial potential of the Cy-domain. Additionally the reaction sequence of peptide bond-formation and cyclization was clarified by mutation of conserved residues within the Cy-domain of the model system. On the basis of mutated synthetases that catalyzes the peptide bond-formation but not the cyclization, the independence of condensation and heterocyclization was demonstrated.


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