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Zusammenfassung:
Die Calcium-abhängige Freisetzung von Neurotransmitter aus sekretorischen Organellen wird durch eine Reihe konservierter Proteinfamilien präzise reguliert. Hierzu zählen u.a. SNARE-Proteine (soluble N-ethylmaleimide-sensitive fusion protein attachment protein (SNAP) receptor ), Rab-GTPasen und SM-Proteine. SNARE-Proteine sind membranständige Proteine, deren gemeinsames Merkmal das 60-70 Aminosäuren umfassende SNARE-Motiv ist. SNARE-Proteine können sich spontan und irreversibel zu einem Vier-Helix-Bündel („core complex“) zusammenlagern. Die Komplexbildung zwischen SNAREs auf Vesikelmembran und Plasmamembran führt zu einer Verkürzung der Proteine. Hierdurch werden die Membranen einander angenähert, was die Voraussetzung für die Membranfusion darstellt. Die funktionelle Bedeutung von SNARE-Proteinen für die Membranfusion wird durch die Vergiftung von Zellen mit den clostridialen Neurotoxinen Tetanustoxin und Botulinustoxin deutlich, die einzelne SNAREs proteolytisch spalten und die Neurotransmission hemmen. Das synaptische SM-Protein Munc-18-1 bindet hochaffin an das SNARE-Protein Syntaxin1. Hierbei konkurriert die Bindung von Munc-18-1 an Syntaxin1 mit dessen Einbindung in den „core complex“. Dies führte zu einem Modell, demzufolge Munc-18-1 durch seine Bindung an Syntaxin1 eine inhibitorische Rolle in der Exozytose übernimmt. Eine rein inhibitorische Funktion von Munc-18-1 läßt sich jedoch nicht mit seinem essentiellen Charakter für die Membranfusion in allen Spezies vereinbaren. Diese zentrale Rolle des Proteins im Membranfusionsvorgang ist jedoch weitgehend unverstanden. In dieser Arbeit wurde die Bedeutung der Interaktion zwischen Munc-18-1 und Syntaxin1 für die Exozytose von sekretorischen Granulen neuroendokriner Zellen in einem kombinierten Ansatz aus biochemischen und elektrophysiologischen Methoden untersucht. Die Interaktion zwischen Syntaxin1 und Munc-18-1 wurde gestört, indem zum einen Munc-18-1 überexprimiert wurde und zum andern in die Syntaxin1-Bindungsregion des Munc-18-1-Moleküls Punktmutationen eingeführt wurden (D34N und R39C). Nach der biochemischen Dokumentation der Störung der Syntaxin1-Bindung wurden die Mutanten sowie das Wildtyp- (WT-) Protein in der neuroendokrinen Zellinie PC12 überexprimiert und die Folgen der Überexpression mit Hilfe der Kohlefaser-Amperometrie elektrophysiologisch charakterisiert. Die Überexpression des Munc-18-WT-Proteins hatte keinen Effekt, was eine inhibitorische Funktion des Proteins unwahrscheinlich macht. Die R39C-Mutante wies eine gewisse Restbindung an Syntaxin1 auf, wohingegen die Bindung der D34N-Mutante an Syntaxin1 vernachlässigbar war. Trotz dieser gleichsinnig veränderten Syntaxin1-Bindung hatten die Mutanten gegensätzliche Effekte auf die Häufigkeit exozytotischer Ereignisse: die Zahl exozytotischer Ereignisse war durch R39C vermindert und durch D34N erhöht. Dies wies auf die Beteiligung eines weiteren Munc-18-1-Bindungspartners an den beobachteten Effekten hin, woraufhin die Interaktion von Mint1 mit Munc- 18-WT,-D34N und-R39C charakterisiert wurde. Mint1 ist ein synaptisches Multidomänen-Protein mit Phosphotyrosin-Bindungsdomänen sowie PDZ-Domänen, die die Interaktion mit weiteren präsynaptischen Proteinen vermitteln und Mint1 somit in die vielfältigen Protein-Interaktionen der Präsynapse einbetten. Die Beobachtung, daß bei gleichzeitiger Anwesenheit von Syntaxin1 und Mint1 die D34N-Mutante und die R39C-Mutante unterschiedliche Proteininteraktionen bevorzugten (Mint1/Munc-18-Komplex, bzw. Munc-18/Syntaxin1-Komplex), führte zu der Hypothese, daß der stimulatorische Effekt der D34N-Mutante durch die beobachtete gehäuft auftretende Interaktion mit Mint1 verursacht wird. Eine elektrophysiologische Charakterisierung des Mint1-Proteins in PC12-Zellen zeigte, daß Mint1 eine Inhibition der Exozytose verursacht. Die stimulierende Wirkung der D34N-Mutante könnte somit auf eine vermehrte Interaktion mit Mint1 zurückzuführen sein und eine Disinhibition darstellen. Die R39C-Mutante entfaltete ihre inhibitorische Wirkung vermutlich über die abgeschwächte Syntaxin1-Bindung. Zusammengefaßt hat Munc-18-1 eine positive Funktion in der LDCV-Exozytose. Zudem beschränkt sich die Rolle von Munc-18-1 nicht auf seine Interaktion mit Syntaxin1. Munc-18-1 ist über die Interaktion mit Mint1 vermutlich in vielfältige präsynaptische Komplexe involviert und könnte während der Membranfusion ein entscheidendes Bindeglied zwischen der Membranfusionsmaschinerie und strukturgebenden Komponenten der Präsynapse darstellen.

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