1.9. Histologische Färbungen

1.9.1. Allgemeine Grundlagen

Substanzen, die im durchfallendem Licht farbig erscheinen, absorbieren einen Teil des Spektrums des sichtbaren Lichtes, dessen vollständige Mischung dem Auge weiß erscheint. Im Bereich der Wellenlängen zwischen 400 und 800 nm sind die Spektralfarben angeordnet, die zwischen Ultraviolett am kurzwelligen Ende und Infrarot am langwelligen Ende definiert sind. Wird aus dem weißen Licht ein Teil des Spektrums absorbiert, registriert das Auge einen Farbeindruck, also beim Durchtritt von Licht durch ein farbiges Medium oder bei Reflexion an einer farbigen Oberfläche. Dabei sind der absorbierte und der wahrgenommene Teil des Spektrums einander komplementär: die gesehene Farbe ist die Komplementärfarbe des absorbierten Teil des Spektrums. Farbe und Komplementärfarbe addiert ergeben wieder das gesamte Spektrum, also Weiß.

Üblicherweise unterscheidet man zwischen Naturfarbstoffen und synthetischen Farbstoffen, wobei in letzter Zeit die Grenze zwischen beiden Gruppen undeutlich wurde264. Manche ehemaligen Naturfarbstoffe werden heute synthetisch hergestellt, so zum Beispiel Indigo. Daneben gibt es Naturfarbstoffe, deren chemische Konstitution noch nicht vollständig geklärt ist, und solche, deren Aufbau zwar bekannt ist, deren Synthese aber aufwendiger wäre als ihre natürliche Gewinnung. Traditionell werden die synthetischen Farbstoffe auch Anilinfarben genannt, da die synthetischen Farben früher als Anilinderivate anfielen. Synthetische Farben sind klar definierte organische Verbindungen.

Zwischen dem Auftreten bestimmter Atomgruppen im Molekül und dem Phänomen der Farbigkeit besteht ein eindeutiger Zusammenhang. Solche Gruppierungen werden Chromophore genannt. Im wesentlichen handelt es dabei um Äthylen-(C=C), Karbonyl-(C=O), Karbamin-(C=N), Nitroso-(N=O) und Nitrogruppen (NO2). Von besonderer Bedeutung für die Farbe eines Moleküls sind die Zahl der Doppelbindungen und die Anordnung von Kohlenstoffdoppelbindungen zueinander und zu anderen chromophoren Gruppen, wobei in kräftig gefärbten Verbindungen konjugierte Doppelbindungen auftreten, wie sie im Chinon exemplarisch gegeben sind:

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 Aromatische Verbindungen, die chromophore Gruppen enthalten, werden Chromogene genannt. Dies sind Verbindungen, mit denen gefärbte Lösungen hergestellt werden können, die aber meist nicht an ein Substrat binden, um es zu färben. Die Einführung auxochromer Gruppen verleiht dem so entstehenden Farbstoffmolekül elektrische Ladung (positiv oder negativ geladenen=basische oder saure Farbstoffe). Chromogen und basebildene auxochrome Gruppe ergibt einen basischen Farbstoff, Chromogen und säurebildene auxochrome Gruppe ergibt einen sauren Farbstoff. Es können auch mehrere und unterschiedlich geladene auxochrome Gruppen an einem Farbstoffmolekül auftreten.

Die Bindung der auxochromen Gruppen und damit die Bindung des Farbstoffes an das Substrat kann direkt erfolgen, oder unter Einschaltung eines zwei- oder dreiwertigen Metallions, das unter Ausbildung einer Chelatbindung das Farbstoffmolekül indirekt an der auxochromen Gruppe fixiert. Die am häufigsten verwendeten Metallionen sind Aluminium. Eisen, Chrom, Wolfram, Molybdän und Kupfer.

Schwierigkeiten der Standardisierung und damit der Vergleichbarkeit von Färberesultaten beruhen im wesentlichen auf dem Zusammenspiel folgender Faktoren, die in unterschiedlichem Ausmaß Einfluß nehmen können264:

Ä Einfluß der Fixierung, nicht nur die Art der Fixierung, auch die Dauer und die Sorgfalt, die vor dem Entwässern für das Auswaschen des Fixiermittels aufgewendet wurde.

Ä Einfluß der Gewebestruktur, wobei die relativ großen Farbstoffmoleküle unter Umständen am Eindringen und Färben engmaschiger Anteile räumlich gehindert werden können.

Ä Unterschiedliche Färbelösungen können ohne Wissen des Experimentierenden vorliegen, z.B. durch unterschiedliche Farbstoffpräparate, Veränderungen, die durch längeres Stehen der Färbelösungen auftreten (Luftoxidation des Farbstoffes, Abdampfen alkoholischer Lösungsmittel und damit Konzentrationssteigerung nichtflüchtiger Substanzen).

Ä Unterschiedliche Färbetechniken, wie etwa Einflüsse der Färbezeit und -temperatur.

 

1.9.2. Arten der histologischen Färbung

Als histologische Färbung im eigentlichen Sinn bezeichnet man die Art der Schnittfärbung, bei der ein Farbstoff, der in Lösung angeboten wird, an definierte Gewebestrukturen bindet. Daneben laufen aber auch andere Verfahren unter der Bezeichnung Färben, wie z.B. Lösen eines Farbstoffes in Gewebekomponenten, Injektion von unlöslichen Pigmenten in den zu untersuchenden Organismus oder Injektion gefärbter Substanzen in natürliche Hohlräume des Organismus. Im folgenden wird nur auf Schnittfärbungen eingegangen.

Von der Durchführung der Schnittfärbung her unterscheidet man progressive und regressive Techniken. Beim progressiven Färben läßt man die Schnitte so lange in der Färbelösung stehen, bis sie genügend gefärbt sind. Dabei kann das Fortschreiten der Färbung von Zeit zu Zeit kontrolliert und nach Wunsch fortgesetzt werden. Beim regressiven Färben dagegen wird der Schnitt zuerst überfärbt und dann der Überschuß der Farbe durch Auswaschen, sogenanntes Differenzieren, in einer geeigneten Flüssigkeit wieder entfernt. Nach Abschluß des Differenzierens muß die Differenzierlösung sorgfältig abgewaschen werden, um zu verhindern, daß sie über das gewünschte Maß hinaus weiter wirkt und unter Umständen die Färbung zerstört.

Man unterscheidet weiter zwischen direkter (substantiver) und indirekter (adjektiver) Färbung. Substantive Farbstoffe binden direkt ohne Vorbehandlung an die Substrate. Adjektive Farbstoffe hingegen färben erst nach besonderer Vorbehandlung, dem Beizen. Zu den Beizstoffen gehören zum Beispiel Hämatoxylin und Karmin.

Läßt man Mischungen von Farbstoffen gleichzeitig (simultan) oder nacheinander (sukzedan) auf einen Schnitt einwirken, kommt es zur differenzierten Anfärbung unterschiedlicher Gewebeanteile mit den einzelnen Farbstoffen. Je nach der Zahl der kombinierten Farben spricht man von Doppel-, Dreifach- oder Mehrfachfärbungen. Färbt ein Gemisch zweier Farben einen Schnitt in gleichmäßiger Mischfarbe, so ist das keine Doppelfärbung im erläuterten Sinn. Eine echte Mehrfachfärbung liegt dann vor, wenn Zellkerne z.B. durch Karmin rot und gleichzeitig elastisches Material durch Resorcinfuchsin dunkelviolett gefärbt werden. Es treten auch Effekte von Mehrfachfärbungen auf, wenn ein Farbstoff das Präparat diffus anfärbt und an gewissen Stellen durch einen zweiten Farbstoff überlagert wird. Wenn z.B. ein mit Hämalaun-Eosin gefärbtes Präparat blau und rot gefärbt erscheint, so beruht das nicht darauf, daß die Zellkerne nur durch Hämalaun, nicht aber durch Eosin gefärbt wären; in Wirklichkeit werden auch die Kerne durch Eosin gefärbt, ihre Rotfärbung wird aber im fertigen Präparat durch die Blaufärbung mit Hämalaun überdeckt.

Bei Mischung verschiedener saurer Farbstoffe besitzen die einzelnen Komponenten des Farbgemisches verschiedene Diffusionsgeschwindigkeiten. Der differente Färbeeffekt beruht dann darauf, daß die rascher diffundierende Farbe in dicht gefügte Gewebeanteile eindringt, während die langsameren Farben von solchen Strukturen ausgeschlossen bleiben.

Unter Einschlußfärbungen versteht man die Situation, daß der Schnitt am Objektträger mit etwas Färbelösung betropft und dann mit einem Deckglas bedeckt wird; überschüssige Färbelösung wird abgesaugt. Diese von Feyrter75 eingeführte Technik eignet sich aber nur für ganz wenige Färbungen.

 

 

1.9.3. Färbetheorien

Eine einheitliche Färbetheorie für die histologische Färbung kann es nicht geben, da der Mechanismus der Farbstoffbindung für die Einzelkomponenten der Gewebe verschiedenartig ist. Unter Berücksichtigung dieser Überlegung muß festgehalten werden, daß histologische Färbemethoden nicht isoliert als Farbreaktionen der Gewebebestandteile zu deuten sind, sondern nur in Verbindung mit dem chemischen und morphologischen Verhalten der dargestellten Strukturen.

Chemische Färbetheorie:

Die Auffassung, die Farbstoffbindung durch eine bestimmte histologische Struktur sei eine Salzbindung zwischen einer Farbstoffbase und sauren Gewebeanteilen (bzw. saurer Farbstoff und mit basischem Gewebeanteil) wurde von Paul Ehrlich (1903) vertreten. Romeis führt kritischerweise an, daß es zur Farbstoffbindung an histologischen Strukturen nur dann kommen kann, wenn solche Salze in der Farbstoffkomponente selbst, bzw. im Lösungsmittel derselben, unlöslich sind264.

Elektrostatische Färbetheorie:

Die von Pischinger entwickelte Theorie der elektrostatischen Absorption der Farbstoffe spielt eine vermittelnde Rolle zwischen physikalischer und chemischer Färbetheorie246. Nach Romeis ist sie die einzige Theorie, die eine einleuchtende Erklärung für viele, in der histologischen Technik seit langem empirisch gefundene und befolgte Rezepturen abgibt.

Die Theorie geht davon aus, daß ein gegebener Farbstoff als Farbbase (positive geladenes Farbstoffion) oder als Säure (negativ geladenes Farbstoffion) vorliegt. Die Gewebestrukturen des histologischen Präparates repräsentieren im wesentlichen Eiweißkörper (Proteine, Glykoproteine, Nukleoproteine), die als Ampholyte positiv oder negativ geladen sein können, je nach dem pH-Wert ihres isoelektrischen Punktes und dem pH-Wert des umgebenden Mediums. Daraus folgt, daß ein positiv geladener Farbstoff einen Eiweißkörper in einer Lösung, die saurer ist als der isoelektrische Punkt des Eiweißkörpers, nicht färben wird (gleiche Ladungen stoßen sich ab), beim pH-Wert des isoelektrischen Punktes nur schwach (wenige negative Ladungen am Eiweißkörper), bei pH-Werten über dem isoelektrischen Punktes aber stark anfärben wird (viele negative Ladungen am Eiweißkörper).

Theorie der indirekten Färbung:

Indirekte Färbungen schließen prinzipiell zwei Probleme ein: die Bindung eines Beizenstoffes an das Substrat und an das Farbstoffmolekül. Nach Romeis sind dabei drei Vorgehensweisen denkbar:

1. Die Beize erst auf das Substrat einwirken lassen und dann zu färben

2. Beize und Farbstoff mischen und mit dem entstehenden Farblack zu färben, und

3. erst zu färben und dann die Beize einwirken lassen.

Die letzte Art der Färbung wird nur selten angewandt.

Als Beizen werden meist Salzlösungen von Aluminium, Chrom, Eisen oder ähnlich guten Komplexbildnern verwendet. Diese Ionen bilden mit den Farbstoffmolekülen Chelatverbind-ungen. Differenzierung und Entfärbung nach indirekter Färbung erzielt man durch Behandlung mit der Beizenlösung; dabei kommt es zu einer Rückverteilung der komplex gebundenen Farbstoffmoleküle vom substratgebundenen Metallion an die frei in der Beize im Überschuß verfügbaren Metallionen.

Farbstoffverteilung im histologischen Präparat:

Neben der selektiven Farbstoffbindung führt auch eine unterschiedliche Verteilung des Farbstoffes zu brauchbaren Färbeergebnissen.

So wird die Farbstoffverteilung im Gewebe allein durch die Dichte der Strukturen beeinflußt. Damit ist nicht gemeint, daß eine höhere Konzentration von färbbarem Material zu intensiveren Färbungen führt, sondern daß der Farbstoff, welcher mit bestimmten Substanzen keine spezifische Bindung eingeht, aus dichterem Material schwerer herauszulösen ist als aus locker gefügtem.

Werden mehrere Farbstoffe zugleich angeboten, spielt die Diffusibilität der einzelner färbenden Komponenten für das Ergebnis eine entscheidenen Rolle. Ein Farbstoff wird im Vergleich zu anderen, gleichzeitig angebotenen Farbstoffen einmal relativ schneller, einmal relativ langsamer diffundieren. Damit hat er einmal Gelegenheit, vor den anderen Farbstoffen, ein andermal nach ihnen zu den für elektrostatische Bindungen zur Verfügung stehenden Stellen zu kommen. Wird zum Beispiel bei Massons Trichromfärbung Säurefuchsin mit Anilinblau zusammen eingesetzt, so färbt Anilinblau das Kollagen, und Säurefuchsin das Zytoplasma. Solche Überlegungen gelten aber nur, wenn eine begrenzte Färbezeit vorausgesetzt wird; bleiben die Schnitte genügend lange in der Färbelösung, wird sich ein Gleichgewicht der Farbstoffbindung einstellen.

 

1.9.4. Färbemethoden

Im folgenden soll nur auf die in unserer Studie verwendeten Farbstoffe und Färbemethoden eingegangen werden.

Hämatoxylin:

Hämatoxylin ist ein Naturfarbstoff, der durch Ätherextraktion aus den zerkleinerten roten Kernholz des in Mittelamerika heimischen Campechebaumes (Blauholz, Haematoxylon campechianum) gewonnen wird. Der wirksame Farbstoff ist allerdings nicht das Hämatoxylin selbst, sondern sein Oxidationsprodukt Hämatein. Durch Verlust zweier Wasserstoffatome entsteht bei der Oxidation die folgende Struktur:

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                                                                                            C16H14O6                                                                              C16H12O6

Die Oxidation von Hämatoxylin zu Hämatein (Reifen) geschieht allein durch den Luftsauerstoff innerhalb einiger Wochen, kann aber durch den Einsatz von Oxidantien unmittelbar erzielt werden (künstliche Reifung). Durch weitere Oxidation aus Hämatein entsteht Oxihämatein, welches für die Färbungen unbrauchbar ist, weshalb die Färbelösungen mit der Zeit an Färbekraft verlieren.

Hämatein ist ein schwach negativ geladener Farbstoff. Erst durch den Zusatz verschiedener Alaunsalze entstehen Hämatoxylinlacke, die stark positiv geladen sind und sich zur progressiven Anfärbung besonders der Zellkerne eignen. Bei der Ausbildung der Farblacke kommt es zu Komplexverbindungen von Hämatein mit den jeweiligen Metallionen der Alaune. Die Farbe der Hämatoxylinlacke ist abhängig vom pH-Wert: unter pH=3 erscheinen die Lösungen rotbraun, bei höheren pH-Werten tritt die bekannte, charakteristische blaue Farbe auf. Meist färbt man in sauren Lösungen und führt dann den Hämatoxylinlack durch Spülen in Leitungswasser in seine blaue Form über (Bläuen). Dies bedeutet gleichzeitig eine Fixierung der Färbung, da die Hämatoxylinlacke bei höherem pH-Wert schwer löslich sind.

Hämalaune:

Die Formel unten zeigt, daß einzig das Aluminiumion für die Bildung des Hämalauns maßgeblich ist. Hämalaune sind keine Beizstoffe im eigentlichen Sinn, sondern, wie alle Hämateinlacke, Komplexverbindungen von Metallionen, die als Doppelsulfate (Alaune) eingesetzt werden. So kann z.B. Eisen als Eisenhämalaun Fe2(SO4)3Ÿ (NH4)2SO4Ÿ 24 H2O, aber auch als Eisenchlorid FeCl3 verwendet werden.

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 Hämalaun als positiv geladener Farbstoff ist geeignet, ganz allgemein Basophilie einer Struktur anzuzeigen. Die selektive Kernfärbung, die man bei Hämalaunfärbungen fast ausschließlich wünscht, wird durch die Azidität der Farbstofflösung und durch einen Überschuß an Alaun erreicht. Ein oft benutztes Hämalaun ist Mayers saures Hämalaun. Dieser Hämalaunansatz ist sofort nach der Bereitung verwendbar und liefert eine sehr selektive, starke, blaue Kernfärbung. Die Farblösung ist sehr bequem zu handhaben, da ein Überfärben praktisch nicht möglich ist, aber auch schon nach kurzer Zeit eine kräftige Anfärbung bewirkt.

Mit Hämalaunen färbt man progressiv. Da die Lösungen angesäuert sind und reichlich verschiedene Elektrolyte enthalten, ist die Gefahr des Überfärbens gering. Man kann den Stand der Färbung jederzeit kontrollieren, wenn man den Objektträger aus der Lösung nimmt, ihn kurz mit Aqua dest. spült, im Leitungswasser bläut und unter dem Mikroskop betrachtet. Je nach Ergebnis kann die Färbung unterbrochen oder fortgesetzt werden. Zum Differenzieren kommen saure Medien in Betracht. Man verwendet dazu schwache Säuren, etwa 2%ige Essigsäure oder 0,25%ige Salzsäure. Die Hämalaunfärbung führt in erster Linie zur kontrastreichen Darstellung der Zellkerne in blauem oder violettem Farbton, sie ist im wesentlichen eine Kernfärbung. Daneben färben sich auch Ergastoplasma, Muzin und Bakterien blau. Bei Verwendung alter Färbelösungen kann es zur grauen oder zart graublauen Anfärbung des Hintergrundes kommen.

Eisenhämatoxyline:

Während die oben aufgeführten Hämalaune bei richtiger Anwendung hauptsächlich reine Chromatinfärbungen sind, lassen sich mit Eisenhämatoxylinen oft auch andere Gewebsbestandteile und zytologische Details selektiv anfärben. Die Kernfärbung mit Eisenhämatoxylin zeigt große Resistenz gegen Differenzierlösungen oder gegen weitere saure Farbstoffe. Sie sind daher den Hämalaunen dann vorzuziehen, wenn die Kernfärbung durch eine Reihe aggressiver oder saurer Lösungen erhalten werden soll.

Dreiwertiges Eisen wird meist in Form von Eisenhämalaun eingebracht. Im Farbstoff dürften verschiedene Komplexverbindungen von Hämatein und Fe3+ gebildet werden, abhängig von den Konzentrationsverhältnissen dieser beiden Komponenten291. Zur Chemie des Bindungsmechanismus ist nichts näheres bekannt; einzig die zentrale Bedeutung von Aminogruppen für die Färbung gilt als gesichert.

In unserer Studie wurde Weigerts Eisenhämatoxylin verwendet. Dieses liefert eine distinkte, und dauerhafte Kernfärbung, vor allem auch an entkalktem Material. Als Stammlösung dienen eine Hämatoxylinlösung und eine Eisenchloridlösung, die erst kurz vor Gebrauch gemischt werden. Beim Mischen verändert sich die Farbe von blauschwarz zu braunschwarz. In den gefärbten Präparaten erscheinen die Zellkerne wieder blauschwarz. Bei richtiger Färbedauer ist ein Differenzieren unnötig.

Kernfärbungen mit Thiazinfarbstoffen:

Thionin, Toluidinblau O und Methylenblau sind Thiazinfarbstoffen. Wir verwendeten das Toluidinblau O in unserer Studie zur Übersichtsfärbung. Alle Thiazinfarbstoffe ergeben gute Kernfärbungen in kräftig blauem Farbton. die Farbstoffe werden als 1%ige wäßrige Lösung verwendet, was beinahe einer gesättigten Lösung dieser Farbstoffe entspricht. Die Färbezeit ist umgekehrt proportional zur Farbstoffkonzentration und ergibt sich aus der Praxis. Bei konzentrierten Lösungen für Übersichtsfärbungen genügen 10 bis 20 Minuten. Mit sehr verdünnten Lösungen kann man bis 24 Stunden färben. Im Falle des Überfärbens differenziert man mit einem Salzsäure-Alkohol-Gemisch.

Färbung mit Eosin und Erythrosin:

Eosin ist die gebräuchlichste Plasma- und Gegenfärbung. Es wird in 0,1%iger wäßriger Lösung angewendet. Man färbt zwischen 5 und 15 Minuten, wäscht in Aqua dest. aus und differenziert mit 80%igem Alkohol. Auf 100ml Färbelösung kann man einen Tropfen Eisessig zusetzen, um die Färbeintensität zu erhöhen.

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Werden im Eosinmolekül Brom- gegen Jodatome ausgetauscht, erhält man Erythrosine. Das heute ausschließlich verwendete Erythrosin B enthält nur noch Jodatome.

Färbung mit Orange G:

Orange G, ein Azofarbstoff, hat wie das Eosin als Plasma- und Gegenfarbstoff weite Verbreitung gefunden. Meist wird es in Kombination mit anderen Farbstoffen bei Mehrfachfärbungen eingesetzt, so z.B. in der von uns benutzten Trichromfärbung nach Masson-Goldner. Zur Plasmafärbung verwendet man Orange G als 0,5 bis 1%ige wäßrige Lösung. Nach 5 bis 10 Minuten Färbung spült man in Aqua dest. und kann dabei auch durch längeres Wässern differenzieren.

Färbung mit Lichtgrün und Säurefuchsin:

Die beiden chemisch verwandten Farbstoffe gehören zur Gruppe der Triarylmethane und werden als Plasmafarbstoffe in 0,5 bis 1%igen wäßrigen Lösungen verwendet, denen auf 100ml ein Tropfen Eisessig zugesetzt wird. Wir verwendeten sie bei der Trichromfärbung nach Masson-Goldner. Nach 5 bis 10 minütigem Färben wird in Aqua dest. ausgewaschen, entwässert und eingedeckt.

In unserer Untersuchung arbeiteten wir mit vier Färbungen: Färbungen nach Giemsa und mit Toluidinblau O dienten zur Darstellung der Übersichtspräparate; als Doppel- oder Mehrfach-färbungen verwendeten wir Trichromfärbung nach Masson-Goldner und Färbungen mit Hämatoxylin-Eosin. Die unterschiedlichen Vorgehensweisen bei Färbungen von Paraffinschnitten und Schliffpräparaten wurde in Vorversuchen ermittelt (siehe unten).

Färbung mit Toluidinblau O: Diese Färbung zeichnet sich durch Einfachheit und gute Standardisierung aus. Sie bietet Differenzierungsmöglichkeiten durch metachromatische Farbeffekte. Mineralisierte Hartgewebe bleiben ungefärbt bis blaßblau, Zellen, Zellkerne, Osteoidsäume, Kittlinien, Kollagenfasern sind blau, Mastzellengranula, Knorpelmatrix, frühe Wundheilungsareale metachromatisch rotviolett gefärbt.

Färbung nach Giemsa: Diese Färbung liefert guten Farbkontrast zwischen Zellen und der Interzellularsubstanz der Weich- und Hartgewebe; außerdem läßt sie zusätzlich an nicht entkalkten Schliffpräparaten, wie bei der Toluidinfärbung auch, Veränderungen der Zahnhart-substanzen erkennen. Mineralisierte Hartgewebematrix wird rosa bis zartrosa, Kollagen und Osteoid blaßblau, Zellen und Zellkerne unterschiedlich blau, eosinophile Granula (z.B. in Granulozyten) rot, Mastzellgranula und Knorpelmatrix rotviolett dargestellt.

Trichromfärbung nach Masson-Goldner: Diese ist eine der vielen Trichromfärbungen und gilt heute als Standartfärbung für die Zahn- und Knochenmorphometrie, da neben guter Zellfärbung mineralisierte und nicht-mineralisierte Knochenmatrix farblich klar unterschieden werden können. Mineralisierte Hartgewebematrix und Kollagen werden leuchtend grün, Osteoid bzw. Wurzelzement rot, Zellkerne blauschwarz, Zytoplasma rötlich-braun, Erythrozyten orange angefärbt.

Doppelfärbung mit Hämatoxylin-Eosin: Diese rasche und einfache Färbung ist die Standartfärbung für die Routine des histologischen Labors. Sie zeigt Zellkerne, saure Substanzen und grampositive Bakterien blau, alles übrige in den verschiedenen Tonabstufungen rot. Romeis empfiehlt Mayers Hämalaun zur Färbung; es kann aber jede andere Hämatoxylinfärbung zur Anwendung kommen.

 

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